抗線蟲方法和組合物的制作方法
【專利摘要】提供了使用線蟲起源的融合家族（Fusion?Family，F(xiàn)F）蛋白的在細胞-細胞融合中有用的方法和組合物。還提供了利用該線蟲融合家族的促融合蛋白（fusogenic?protein）的抗線蟲方法和組合物。
【專利說明】抗線蟲方法和組合物
發(fā)明領域
[0001 ] 本發(fā)明涉及使用線蟲融合家族蛋白的在細胞-細胞融合中有用的方法和組合物。 還提供了利用線蟲融合家族的促融合蛋白（fusogenic protein)的抗線蟲方法和組合物。
[0002]發(fā)明背景
[0003]從小的細胞內的囊泡和細胞器至整個細胞的范圍，幾乎所有的膜都能夠融合。因此，膜融合對許多生物過程諸如受精、胚胎及胚后發(fā)育、細胞內轉運和病毒感染至關重要 (1-6)。外質膜細胞融合過程包括質膜的合并。該過程可以是瞬時的，如在精卵融合的情況下，導致繼續(xù)分裂的二倍體細胞，或永久性的，導致合胞體多核細胞的形成。此合胞體作為后生動物中一些體細胞組織的必要組成部分，包括肌肉形成中的肌管、骨形成中的破骨細胞和哺乳動物胎盤形成中的合胞體滋養(yǎng)細胞。外質膜細胞融合還在特定的病毒感染過程中發(fā)生，由于包膜病毒(諸如，例如，流行性感冒、HIV和狂犬病毒）將它們的膜與宿主的質膜或內體膜融合。與外質膜細胞-細胞融合相似，病毒-細胞融合在融合膜的外層之間發(fā)生且，這樣與在細胞內發(fā)生的內質融合事件在許多方面不同(例如，液泡膜在細胞器之間的轉運)。
[0004]膜融合的分子機制的現(xiàn)有模型依賴于主要針對病毒的和細胞內的融合介導蛋白 (被稱為促融合劑（fusogen))執(zhí)行的實驗和生物物理分析。然而，這些模型如何對應細胞-細胞促融合劑的作用機制是未知的（4，5 )。例如，美國專利號US7，402，409涉及細胞融合方法。另外的細胞融合方法，例如被Gottesman等人（18)描述。
[0005]來自線蟲秀_隱桿線蟲（C.elegans)的 AFF-1 (Anchor-cell Fusion Failure-1) 和EFF-I (Epithelial Fusion Failure-1)蛋白是首個被鑒定并因此是線蟲中保守的促融合劑（即，通過細胞的脂質雙分子層的融合介導細胞與細胞的融合的蛋白）家族的創(chuàng)始成員（4)。秀麗隱桿線蟲FF蛋白（CeFF’ s)被顯示誘導異源昆蟲細胞中的融合(例如，參考文獻7-11)。aff-1和eff-1突變體是可存活的，但具有嚴重的身體畸形和與細胞融合失敗相關的生殖缺陷（9，10)。EFF-I作為促融合劑的功能需要其在兩個融合配偶體中的表達（8)。 融合家族（EF)家族的蛋白在線蟲中是非常保守的。在不同的線蟲種類中鑒定出FF成員， 表明FF家族在線蟲動物門是保守的（4)。只有少數(shù)的EF家族成員在線蟲外被鑒定出，它們中沒有一個在植物或在脊索動物中。
[0006]線蟲是最多樣化的假體腔動物門，并是所有動物中的最多樣化之一。已描述了超過28，000種線蟲種類（12)且約16，000種線蟲是寄生的。線蟲已適應于幾乎每一個已知的生態(tài)系統(tǒng)。
[0007]一般來說通過線蟲的感染且特別是寄生線蟲可影響不同的宿主，諸如，例如，牲畜、人、海洋生境、植物等等（13)，導致健康相關的和經(jīng)濟的后果。因此，感染的有效防治將對農業(yè)、耕作和醫(yī)學與由此產生的經(jīng)濟影響作出顯著貢獻。例如，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization)估計至少20億人被寄生線蟲感染,而估計植物寄生線蟲的損害在美國每年造成的損失為~40-100億美元并在全世界每年造成的損失超過$800億。目前在使用中的抗線蟲劑(還被稱為抗螺蟲藥（antihelminthic)、打蟲藥（anhelmintic)和殺螺蟲藥(vermicide)),主要包括被設計以殺死寄生蟲或將其從其宿主中排出的化學品、藥物或天然產生的化合物。然而，這些抗線蟲劑的大部分是劇毒的且如果以不當?shù)膭┝渴褂脤θ耸俏ｋU的。此外，化學品的持續(xù)使用導致抗性蠕蟲的積累且不可避免地導致治療的失敗。另外，防治病原體諸如寄生線蟲可能是極其昂貴的。
[0008]因此，對特異的、安全的、無毒的、經(jīng)濟的并對環(huán)境具有最小的影響的新的抗蠕蟲方法和組合物有未滿足的需求。使用線蟲促融合劑作為外生表達的、用于病毒顆粒與細胞的融合或植物和動物界的高等生物的細胞之間的細胞-細胞融合的介質在本領域中未被教導或提出。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明提供了使用包括線蟲起源的促融合劑的至少胞外部分的促融合蛋白，用于包括但不限于哺乳動物細胞、植物細胞、鳥類細胞和類似的細胞的融合，和細胞與病毒顆粒的融合的方法和組合物。本發(fā)明還公開了抗線蟲方法和組合物、用于它們的制備的方法、和其用途。
[0011]本發(fā)明部分基于以下出乎意料的和令人驚訝的發(fā)現(xiàn):保守的真核促融合劑諸如融合家族蛋白的線蟲促融合蛋白通過取代內源的病毒促融合蛋白能夠介導病毒的包膜與細胞的融合。本發(fā)明進一步部分基于以下出乎意料的發(fā)現(xiàn):融合家族(FF)蛋白是在物種之間且甚至在線蟲門之外可以是可互換的膜促融合劑的家族，并因此當在那些細胞的膜上表達時該家族的同源物(homolog)可被用于非昆蟲細胞的融合。此類發(fā)現(xiàn)是令人驚訝的并出乎意料的，因為由秀麗隱桿線蟲FF蛋白介導的異源昆蟲細胞中的誘導融合，并不指示或表明此融合蛋白(fusion protein)能夠:取代內源病毒促融合蛋白或FF蛋白在物種之間是可互換的并能夠被用于高等、非昆蟲生物的細胞的融合。
[0012]根據(jù)一些實施方案， 提供了用于特定的、蛋白介導的細胞與細胞融合的方法。介導融合的蛋白是融合蛋白，例如線蟲起源的、在細胞表面表達從而允許/誘導/介導細胞的融合的融合蛋白。在一些實施方案中，相同的促融合蛋白在第一和第二細胞的表面表達。在一些實施方案中，每一種細胞表達不同的融合蛋白，兩種促融合蛋白都屬于促融合蛋白的同一家族(同型的)。在一些實施方案中，促融合蛋白是內源表達的蛋白。在一些實施方案中，對于至少一種待被融合的細胞，促融合蛋白是外源蛋白。在一些實施方案中，細胞具有相似的起源。例如，兩種細胞可以是哺乳動物細胞。在一些實施方案中，細胞具有不同的起源。在一些示例性的實施方案中，第一細胞是假型包膜病毒且另外的(第二)細胞具有線蟲起源。在其他示例性的實施方案中，第一細胞是假型包膜病毒且另外的(第二)細胞具有哺乳動物或植物起源。在一些實施方案中，至少一種待被融合的細胞不是昆蟲細胞。在一些實施方案中，細胞是高等動物或植物界的。每一種可能性是一個單獨的實施方案。
[0013]根據(jù)一些實施方案，提供了用于融合第一細胞和第二細胞以產生融合的雜交細胞的方法，該方法包括將包括第一外源線蟲促融合蛋白的第一細胞與包括第二外源線蟲促融合蛋白的第二細胞混合/孵育/放置；因此融合第一和第二細胞。在一些實施方案中，第一細胞和第二細胞具有相同的起源。在一些實施方案中，當?shù)谝患毎偷诙毎哂邢嗤钠鹪磿r，細胞不是昆蟲細胞(即非昆蟲細胞)。在一些實施方案中，第一細胞和/或第二細胞是非昆蟲細胞。在一些實施方案中，第一細胞和第二細胞具有不同的起源。在一些實施方案中，細胞選自:病毒(病毒顆粒)、植物細胞、鳥類細胞、動物細胞或人細胞。每一種可能性是一個單獨的實施方案。在一些實施方案中，細胞是非昆蟲細胞。在一些實施方案中，第一促融合蛋白和第二促融合蛋白是相同的。在其他實施方案中，第一促融合蛋白和第二促融合蛋白是不同的。在另外的實施方案中，第一促融合蛋白和第二促融合蛋白選自AFF-1、EFF-1或其同源物。在一些實施方案中，第一外源線蟲促融合蛋白在第一細胞和/或第二細胞中的表達是瞬時的。在一些實施方案中，第一外源線蟲促融合蛋白在第一細胞和/或第二細胞中的表達是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，當?shù)谝患毎偷诙毎哂邢嗤钠鹪磿r，細胞不是線蟲起源。
[0014]根據(jù)另外的實施方案，用于特定的、蛋白介導的、細胞與細胞融合的方法還可被用于免疫治療方法和通過融合抗原提呈細胞與其他細胞的疫苗制作，其中細胞都表達了線蟲起源的融合家族蛋白。
[0015]根據(jù)另外的實施方案，用于特定的、蛋白介導的、細胞與細胞融合的方法還可被用于通過使用生理的及毒性比目前使用的方法少的替代方法融合細胞以產生雜交瘤的單克隆抗體的生產。
[0016]根據(jù)另外的實施方案，用于特定的、蛋白介導的、細胞與細胞融合的方法還可被用于癌癥和干細胞研究和治療領域的細胞-細胞融合的機理研究。
[0017]根據(jù)一些實施方案，提供了包括表達外源的線蟲促融合蛋白的非昆蟲細胞或病毒顆粒的組合物。在一些實施方案中，非昆蟲細胞選自哺乳動物細胞、鳥類細胞、和植物細胞。在另外的實施方案中，促融合蛋白能夠介導細胞或病毒顆粒與表達第二線蟲促融合蛋白的第二細胞的融合。在其他實施方案中，第二細胞選自外源表達第二線蟲促融合蛋白的哺乳動物細胞、鳥類細胞、和植物細胞，或內源表達線蟲促融合蛋白的線蟲細胞。根據(jù)又另外的實施方案，第二線蟲促融合蛋白與非昆蟲細胞的促融合劑是相同的或不同的。每一種可能性是一個單獨的實施方案。
[0018]根據(jù)一些實施方案，提供了用于融合第一細胞和第二細胞的方法，該方法包括:將包括第一外源線蟲促融合蛋白的第一細胞與包括第二外源線蟲促融合蛋白的第二細胞一起孵育；因此融合第一細胞和第二細胞以形成融合細胞，其中至少一種細胞不是昆蟲起源的。在一些實施方案中，第一細胞和第二細胞具有相同的起源。在其他實施方案中，第一細胞和第二細胞具有不同的起源。在一些實施方案中，細胞選自植物、鳥類、動物、人、和病毒顆粒。在另外的實施方案中，第一促融合蛋白和第二促融合蛋白是相同的。在其他實施方案中，第一促融合蛋白和第二促融合蛋白是不同的。在一些實施方案中，第一促融合蛋白和第二促融合蛋白選自AFF-1、EFF-1或其同源物。在其他實施方案中，第一外源線蟲促融合蛋白在第一細胞和/或第二細胞中的表達是瞬時的。在一些實施方案中，外源線蟲促融合蛋白在第一細胞和/或第二細胞中的表達是穩(wěn)定的。
[0019]根據(jù)另外的實施方案，用于特定的、蛋白介導的細胞與細胞融合的方法，可被用于特定地靶向線蟲。該方法包括將線蟲細胞與表達線蟲促融合蛋白的病毒顆粒融合。病毒顆粒和線蟲細胞的特定的融合可導致對線蟲細胞的期望效果，其中效果可在不使用另外的抗線蟲劑的情況下獲得。對線蟲細胞的期望效果，可包括例如殺死細胞、抑制細胞的生長、頓抑細胞、和類似的。在一些實施方案中，僅細胞融合就可導致細胞的死亡。每一種可能性是一個單獨的實施方案。
[0020]根據(jù)另外的實施方案，用于特定的、蛋白介導的、細胞與細胞融合的方法，可被用于特定靶向抗線蟲劑于線蟲。在此類實施方案中，細胞的融合依賴于線蟲起源的促融合蛋白在兩個融合中細胞的膜中的表達，其中促融合蛋白可以是相同的或不同的。在一些示例性的實施方案中，一個(第一)細胞是線蟲起源的(內源表達融合蛋白)和另一個(第二)細胞具有不同的起源(諸如，植物起源、哺乳動物起源、鳥類起源、昆蟲、包膜假病毒等等)，其中另一個(第二)細胞外源表達線蟲起源的促融合蛋白。另一個(第二)細胞可包括一種或多種抗線蟲劑，諸如，例如:化學化合物(諸如，例如，但不限于:有機磷酸酯、氨基甲酸鹽、咪唑衍生物諸如，例如，苯并咪唑、左旋咪唑、殺線蟲熏劑(Fumigant nematicide)、大環(huán)內酯類、除蟲菌素、密比霉素、破傷風毒素、和類似的);核酸(諸如，例如，針對線蟲基因的反義DNA分子；針對線蟲基因的SiRNA或其他dsRNA分子、和類似的);蛋白(諸如，例如，但不限于:能夠裂解線蟲蛋白的酶、針對線蟲蛋白的抗體、毒素、和類似的)，或其組合。當細胞特定融合時，抗線蟲劑可對線蟲發(fā)揮作用。作用可以是，例如，殺死線蟲、頓抑線蟲、和/或抑制線蟲的生長。
[0021]根據(jù)另外的實施方案，用于特定、蛋白介導的、細胞與細胞融合的方法可因此被用于植物、動物和人的寄生線蟲感染的治療。
[0022]根據(jù)一些實施方案，提供了包括表達能夠介導細胞與線蟲細胞的特定融合的外源線蟲促融合蛋白的細胞的組合物；其中細胞包括抗線蟲劑。組合物可被用于殺死線蟲細胞。在一些實施方案中，細胞可選自哺乳動物細胞、(包括任何干細胞)、鳥類細胞、病毒、和植物細胞。外源線蟲促融合蛋白可選自AFF-UEFF-1和其同源物。
[0023]在一些實施方案中，抗線蟲劑可選自化學物質、蛋白、核酸、毒素和其組合。在另外的實施方案中，抗線蟲劑可由細胞表達。
[0024]根據(jù)另外的實施方案，細胞中的外源線蟲促融合蛋白可以是瞬時的。在一些實施方案中，外源線蟲促融合蛋白在細胞中的表達可以是穩(wěn)定的。
[0025]根據(jù)又另外的實施方案，線蟲可選自，但不限于:秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)、秀 HB 小桿線蟲、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramane1、Caenorhabditis brenner1、廣桿屬線蟲種 5、7、9、11 (Caenorhabditis sp5, 7，9，11)、旋毛形線蟲(Trichinella spiral is)、偽方定毛形線蟲(Trichinella pseudospiralis)、巴布亞方定毛蟲、Pristionchus entomophagus、Pristionchus maupas1、圓形線蟲(Pristionchuspacificus)、南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)、花生根結線蟲(Meloidogynearenaria)、北方根結線蟲(Meloidogyne hapla)、馬鈴薯白線蟲(Globodera pallida)、犬鉤口線蟲(Ancylostoma caninum)、馬來布魯線蟲(Brugia Malayi )、搶轉血茅線蟲(Haemonchus contortus)、豬蟲回蟲(Ascaris suum)、Oscheius tipulae、犬惡絲蟲(Dirofilaria immitis)、Howardula aoronymphium、 棉鼠絲蟲(Litomosoidessigmodontis)、大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)、食蚊羅曼索線蟲(Romanomermisculicivorax)、鼠鞭蟲(Trichuris muris)、鼠類圓線蟲(Strongyloids ratti)、旋盤尾絲蟲(Onchocerca volvulus)、環(huán)紋背帶線蟲(Teladorsagia circumcincta)、班氏吳策線蟲(ffuchereria bancrofti)和羅阿絲蟲(Loa loa)。
[0026]根據(jù)一些實施方案，提供了包括病毒的組合物，所述病毒包括/表達線蟲融合蛋白，其中所述促融合蛋白能夠介導病毒與線蟲細胞的融合；其中所述融合誘導殺死線蟲。在一些實施方案中，線蟲促融合蛋白選自AFF-UEFF-1和其同源物。線蟲可選自，但不限于:秀I?隱桿線蟲、秀I?小桿線蟲、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramane1、Caenorhabditis brenner1、廣桿屬線蟲種5、7、9、11、旋毛形線蟲、偽旋毛形線蟲、巴布亞旋毛蟲、Pristionchus entomophagus、Pristionchus maupas1、圓形線蟲、南方根結線蟲、花生根結線蟲、北方根結線蟲、馬鈴薯白線蟲、犬鉤口線蟲、馬來布魯線蟲、捻轉血茅線蟲、豬蛔蟲、Oscheius tipulae、犬惡絲蟲、Howardula aoronymphium、棉鼠絲蟲、大豆胞囊線蟲、食蚊羅曼索線蟲、鼠鞭蟲、鼠類圓線蟲、旋盤尾絲蟲、環(huán)紋背帶線蟲、班氏吳策線蟲和羅阿絲蟲。每一種可能性是一個單獨的實施方案。
[0027]在一些實施方案中，病毒可選自逆轉錄病毒、嗜肝DNA病毒、痘病毒、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)病毒、副粘病毒、皰疫病毒和冠狀病毒。每一種可能性是一個單獨的實施方案。
[0028]根據(jù)另外的實施方案，提供了用于靶向殺死線蟲的方法，該方法包括將線蟲與包括抗線蟲劑的細胞接觸，其中細胞還包括能夠介導該細胞和線蟲細胞融合的外源促融合蛋白；且其中融合誘導殺死線蟲。細胞可選自哺乳動物細胞、干細胞、鳥類細胞、病毒、和植物細胞。在一些實施方案中，外源促融合蛋白是選自AFF-UEFF-1和其同源物的線蟲蛋白。
[0029]根據(jù)另外的實施方案，抗線蟲劑可選自化學物質、蛋白、核酸、毒素和其組合?？咕€蟲劑可由細胞表達。每一種可能性是一個單獨的實施方案。
[0030]根據(jù)一些實施方案，提供了用于靶向殺死線蟲的方法，該方法包括將線蟲與包括能夠介導病毒與線蟲細胞融合的外源線蟲融合蛋白的病毒接觸；其中融合誘導殺死線蟲。在一些實施方案中，外源促融合蛋白是選自AFF-1、EFF-1和其同源物的線蟲促融合蛋白。在一些實施方案中，線蟲可選自，但不限于:秀麗隱桿線蟲、秀麗小桿線蟲、Caenorhabditisjaponica、Caenorhabditis ramanei'Caenorhabditis brenner1、廣桿屬線蟲種 5、7、9、11、旋毛形線蟲、偽旋毛形線蟲、巴布亞旋毛蟲、Pristionchus entomophagus> Pristionchusmaupas1、圓形線蟲、南方根結線蟲、花生根結線蟲、北方根結線蟲、馬鈴薯白線蟲、犬鉤口線蟲、馬來布魯線蟲、搶轉血茅 線蟲、豬蛔蟲、Oscheius tipulae、犬惡絲蟲、Howardulaaoronymphium、棉鼠絲蟲、大豆胞囊線蟲、食蚊羅曼索線蟲、鼠鞭蟲、鼠類圓線蟲、旋盤尾絲蟲、環(huán)紋背帶線蟲、班氏吳策線蟲和羅阿絲蟲。病毒可選自逆轉錄病毒、嗜肝DNA病毒、痘病毒、彈狀病毒科病毒、副粘病毒、皰疫病毒和冠狀病毒。
[0031]根據(jù)又另外的實施方案，提供了用于治療受試對象中線蟲感染的方法，該方法包括對受試對象施用包括表達外源線蟲融合蛋白的細胞的組合物，其中所述細胞和感染受試對象的線蟲細胞的融合誘導線蟲的死亡或抑制線蟲的生長。在一些實施方案中，受試對象是人。在一些實施方案中，受試對象是動物。在一些實施方案中，施用選自口服施用、注射、栓劑和局部施加。在另外的實施方案中，細胞還可包括選自化學物質、蛋白、核酸、毒素和其組合的抗線蟲劑。在另外的實施方案中，細胞可選自哺乳動物細胞、干細胞、鳥類細胞、病毒、和植物細胞。
[0032]根據(jù)一些實施方案，提供了穩(wěn)定表達線蟲家族的促融合蛋白的轉基因植物。
[0033]根據(jù)又另外的實施方案，提供了用于線蟲促融合蛋白在病毒表面表達的病毒載體。
[0034]根據(jù)另外的實施方案，提供了表達編碼包含與線蟲促融合蛋白的氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的重組細胞。在一些實施方案中，細胞可選自哺乳動物細胞、干細胞、鳥類細胞、病毒和植物細胞。在一些示例性的實施方案中，線蟲促融合蛋白選自 Ce-AFF-1 (SEQ ID NO:23),Ce-EFF-1 (SEQ IS NO:24)、tsp_FF_l (SEQ.1D.N0.25)和/或Bfl-FF-1 (SEQ ID N0.26)。每一種可能性是一個單獨的實施方案。
[0035]根據(jù)又另外的實施方案，提供了用于殺死線蟲細胞的組合物，該組合物包括:表達編碼包含與線蟲融合蛋白的氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸的重組細胞，其中所述重組細胞還包括抗線蟲劑。
[0036]根據(jù)一些實施方案，還提供了包括組合物和使用所述組合物治療線蟲感染的說明書的試劑盒，所述組合物包括表達線蟲起源的促融合蛋白的重組細胞。
[0037]本發(fā)明的這些和另外的益處和特征可被本領域的技術人員參考以下采取與附圖結合的詳細描述和非限制性的實施例更好地理解。
[0038]附圖簡述
[0039]被并入并形成說明書一部分的附圖，闡述本發(fā)明的某些實施方案，并與描述一起用來解釋本發(fā)明的原理。意圖是本文公開的實施方案和附圖被認為是說明性的而非限制性的。附圖在下面列出。
[0040]圖1A顯示體外產生重組的單輪感染性VSV Λ G-AFF-1的示意圖。用編碼aff_l(以下表2)的質粒轉染BHK細胞并在細胞表面表達蛋白。隨后用G-補充的VSV Λ G重組病毒(VSVAG-G)感染細胞。病毒基因組編碼GFP取代融合糖蛋白G。感染導致病毒誘導的GFP被靶細胞(灰色細胞質)表達。從上清液中收集VSV Λ G-AFF-1假病毒。
[0041]圖1B顯示表明AFF-1并入假型中的純化的VSVAG_AFF_1假病毒的免疫印跡分析的象形圖。左組(A)描繪了識別75kDa的表觀分子量(麗)的條帶的小鼠抗FLAG抗體。Sf9昆蟲細胞中AFF-1的表觀麗為75 kDa (3)。AFF-1的理論麗為67kDa (8)。額外的條帶反映BHK細胞中AFF-1的低聚物、加工和不同的糖基化。右組(B)描繪了小鼠抗VSV-M抗體，其鑒定了對應于VSV-M的預測分子量(箭頭)的25kDa的表觀分子量的蛋白。
[0042]圖1C顯示總結VSVΛG-AFF-1感染BHK細胞的示意圖。用aff_l、eff_l或載體質粒轉染并用VSVAG-AFF-1感染細胞。用空載體轉染并用禿(bald)顆粒感染的細胞用作陰性對照。
[0043]圖1D顯示代表VSVAG假病毒的滴度的條形圖。指示了在病毒膜上(禿(Bald)或AFF-1)和BHK細胞膜上(載體、AFF-1或EFF-1)的蛋白的類型。使用抗VSVG抗體(a G)以中和任何殘留的VSVΛG-G病毒(在以下圖1F中顯示)。滴度以感染單位(IU)表示，感染單位代表在接種病毒后24小時，每微升表達GFP的細胞的數(shù)量。數(shù)據(jù)為平均值+/-SE (η=3次實驗)。插圖顯示背景感染。
[0044]圖1E顯示經(jīng)感染的BHK細胞的圖像。BHK細胞的感染監(jiān)測為GFP表達；相位對比(上組)對熒光(下組)。比例尺為50 μ m。
[0045]圖1F顯示說明VSV Λ G-G感染表達CeFF的細胞并在抗VSVG存在情況下的條形圖。用VSV Λ G-G假型病毒(1.5X107IU)感染表達AFF-UEFF-1或用空載體轉染的細胞。在抗G抗體(aG) (1:100)存在(+ )或不存在(-)情況下執(zhí)行感染。在24小時后通過FACS檢查細胞(細胞總數(shù)計數(shù)為20，000個細胞)。FF蛋白的轉染/表達沒有影響VSV Δ G-G假型病毒的感染效率(雙側檢驗P值等于0.49-0.89)。a G有效地阻斷了 VSVAG-G的感染。結果以三個獨立實驗的平均值+/_標準誤差呈現(xiàn)。[0046]圖2A-P顯示不同的重組VSV Λ G或表達AFF-1的Sf9細胞的免疫熒光的電子顯微照片。負染的囊泡從以下的病毒獲得:圖2A禿病毒制備物(VSVAG);圖2B VSVAG-G病毒制備物；圖2C-VSV Λ G-AFF-1假型病毒制備物。箭指向表面顆粒。
[0047]抗AFF-1多克隆抗體之后是以下的免疫金標記和負染:
[0048]圖2D-VSV Δ G-G病毒制備物，圖2E-VSV Δ G-AFF-1假型病毒制備物。
[0049]冷凍TEM:圖 2F - VSV Λ G 病毒；圖 2G-VSV Λ G-G ;圖 2HVSV Δ G-AFF-1。
[0050]圖2Ι-Κ-分別顯示來自VSVΛG-AFF-1的斷層照片的頂部(21)、中部(2J)和底部(2Κ)切片。
[0051]圖2L-M顯示來自與顯示五或六聚體“花”形復合物(箭)的VSV Δ G-AFF-1制備物共純化的囊泡的cryoET的切片。
[0052]插圖的比例尺為IOOnm和IOnm ;箭:表面刺突裝配；箭頭:金顆粒；白色方塊:指示顯示插圖中放大的區(qū)域。
[0053]圖2N表達AFF-1-Flag(用3yg/ml aff_l質粒(表2)轉染)的Sf9細胞中的免疫熒光與以下:組么-#8在了851'中被1:500稀釋的抗AFF-1的小鼠多克隆抗體或組B-免疫前血清。第二抗體-在TBST中被1:500稀釋的Alexa Fluor568山羊抗小鼠IgG(H+L, InvitrogenCat#A11004)。每一組中圖片的順序，從左到右:組A:AFF_1 (白色、實線箭(代表紅色));細胞核/細胞質的轉染標記(虛線箭(代表綠色))；DAP1、DNA (長虛線箭(代表藍色))；過度染色。組B:免疫前血清；細胞核/細胞質的轉染標記(虛線箭(代表綠色))；DAP1、DNA (長虛線箭(代表藍色))；過度染色。比例尺為ΙΟμπι。
[0054]圖20 (組A-H)說明免疫金標記的定量。組A-顯示免疫金標記VSV AG-AFF-1(星號)的象形圖。組B顯示具有一些背景染色(箭頭)的免疫金標記的從VSVΛG-AFF-1制備物中分離的囊泡(星號)的象形圖。組C-顯示具有一些背景染色(箭頭)的免疫金標記VSVAG-AFF-l (中部)的象形圖。組D-顯示免疫金標記的囊泡和VSVΛG-AFF-1病毒的象形圖。組E-顯示用抗AFF-1 (陰性對照)抗體染色的顯示一些非特異性免疫金標記(箭頭)的VSV Δ G-G的象形圖。組F-顯示具有一些背景染色(箭頭)的VSV Δ G-G (中部)的象形圖。組G-顯示具有一些背景染色(箭頭)的免疫金標記的從VSVAG-G制備物中分離的囊泡(星號)的象形圖。組H-顯示代表識別病毒和囊泡的金顆粒數(shù)量(Y軸)對用抗AFF-1染色的VSVAG-AFF-1或VSVAG-G樣品的背景的條形圖。抗AFF-1顯示與對照VSV Λ G-G相比的VSV Δ G-AFF-1的特異性病毒/囊泡識別。VSV Δ G-AFF-1和VSV Δ G-G載網(wǎng)之間的背景染色中的差異為非統(tǒng)計顯著的(P=0.4588 ；η=30定量的圖像/病毒)；
[0055]圖2Ρ (組A-C)顯示來自與VSV Λ G-AFF-1共純化的囊泡的cryoET的切片。來自顯示五或六聚體“花”形組裝的囊泡的cryoET的切片的組A-頂部；組B-中部；組C-底部，插圖的比例尺為IOOnm和IOnm;白色方框:顯示插圖中放大的區(qū)域。
[0056]圖3A-0-BHK-AFF-1和BHK-EFF-1細胞的融合。圖3A-C是顏色混合測定的實驗設計的示意圖。圖3D是顯示陰性對照的象形圖。用空載體和(紅色)細胞質標記(RFPnes)或(青色)細胞核標記(CFPnls)共轉染的混合的細胞顯示無顏色混合。比例尺為100 μ m。
[0057]圖3E是顯示混合的表達BHK-AFF-1的細胞(實線箭(代表紅色))和表達BHK-EFF-1的細胞(虛線箭(代表青色))的象形圖。雜合物表達青色的細胞核和紅色的細胞質(如由實線、短箭頭指示的)。[0058]圖3F-H顯示以下的象形圖:圖3F:表達AFF-1的具有(紅色)細胞質(由實線箭代表)的BHK細胞；圖3G:表達EFF-1的具有(青色)細胞核(由虛線箭代表)的BHK細胞；圖3H:在AFF-1在BHK細胞中表達、EFF-1表達在BHK細胞中表達及混合細胞之后出現(xiàn)的具有圍繞兩個(青色)細胞核(由虛線箭代表)的(紅色)細胞質(由實線箭代表)的BHK細胞。(t匕例尺為10 μ m)o
[0059]圖31-K顯示以下的象形圖:圖31:表達AFF-1的具有(紅色)細胞質(實線箭，代表紅色細胞質)的BHK細胞；圖3J:表達AFF-1的具有(青色)細胞核(虛線箭，代表青色細胞核)的BHK細胞；圖3K:具有圍繞青色細胞核(虛線箭，代表青色細胞核)的紅色細胞質(實線箭，代表紅色細胞質)的BHK細胞，其在混合細胞之后出現(xiàn)。
[0060]圖3L-0在餅狀圖中顯示內容物混合實驗的定量，其代表多核化的細胞(2核或更高)的分數(shù)。結果為四次獨立實驗的平均值(n ^ 1000總細胞):圖3L是用空載體轉染的細胞的定量的餅狀圖。所有多核化的細胞都是雙核的(總分裂細胞4%);圖3Μ是與空載體轉染的細胞(虛線箭(代表青色))混合的表達AFF-1的細胞(實線箭(代表紅色))的定量的餅狀圖。僅在表達AFF-1的細胞中觀察到多核化的提高(實線箭，11%;虛線箭，3%)。觀察到具有單核的表達兩個標記(紅色和青色)的一個細胞；圖3Ν是與表達AFF-1細胞(虛線箭(代表青色))混合導致四個細胞群-單核白色和多核紅色(由實線箭代表，13%)、青色(由虛線箭頭代表，12%)和混合的(由長虛線箭(紫色)代表；11%)的AFF-1表達細胞(實線箭頭(代表紅色))的定量的餅狀圖。圖30是與表達EFF-1細胞(虛線箭(代表青色)，11%)混合的表達AFF-1的細胞(實線箭(代表紅色)，9%)的定量的餅狀圖。表達AFF-1和EFF-1的細胞融合(長虛線箭(代表紫色)，18%)。
[0061]圖4A-F真核細胞-細胞促融合劑的FF家族:圖4Α顯示使用最大簡約法分析產生的兩個樹的圖表。分別基于TGFi3 -RI樣域或全長胞外域的25分類單元(左)和14分類單元(右)的系統(tǒng)發(fā)生的關系，顯示FF蛋白分類為三個亞組(EFF-1樣、AFF-1樣和FF)。圖4Β-Ε顯示用抗Flag抗體(實線箭 (代表綠色))，和細胞核DAPI染色(虛線箭(代表藍色))對用以下轉染的BHK細胞的免疫熒光的象形圖:圖4B-空載體；圖4(:-&€卜1 ;圖4D_Tsp-ff-l ；和圖4E-Bfl-ff-l。共轉染標記(初始顏色-紅色)。圖像代表至少八個獨立實驗的數(shù)以百計的區(qū)域。比例代表20μπι。對于未表達構建體(無紅色熒光)的細胞，只有細胞核是可見的。圖4F顯示說明被轉染的表達FF蛋白的BHK細胞和陰性對照的融合指數(shù)的條形圖。數(shù)據(jù)是平均值土SE?？蛰d體，n=14, aff-1, n=14, Tsp-ff-1, n=8 ； , Bfl-ff-1、n=9 ；n 代表實驗數(shù)。
[0062]圖5顯示AFF-1-介導哺乳動物細胞的融合的時間推移圖像。用AFF-1和pRFPnes(白色)共轉染的BHK細胞。細胞如由標記從較亮的細胞(36min，星號)至較大的細胞的擴散所指示那樣融合。72分鐘之后，標記均勻地分布并從第二細胞核(箭頭)排除。比例尺20 μ m。n>3次實驗。
[0063]圖6A-C顯示FF蛋白的序列分析。圖6A顯示FF旁系同源物(paralogs)和直向同源物(orthologs)中的保守的序列基序的分布。序列基序被編號(顏色代碼):I (代表綠色)-信號肽(SP);II (代表粉紅色)-前域；III (代表棕色)-TGFP-R1-樣域；IV (代表黃色)-“[LMF]-G-W-[YFL]-[RK]基序”;V (代表青色)-推定的蛋白-蛋白互作域；VI (代表紫色)-膜近端干域，VII (代表赭色)-跨膜域(TM)。秀麗隱桿線蟲的旁系同源物通過基因名稱AFF-1、EFF-1、EFF-2 (C26D10.7)被列出。還顯示了 EFF-1的可變剪接變異體(EFF-1A-D)0將與AFF-1的整體序列同一性顯示在基因名下。將與AFF-1的局部序列同一性(％)顯示在每一個域內。除非與之前在關于EFF-1異構體情形下顯示的示意圖一致，否則將序列限制顯示在圖下。將從佛州文昌魚v2.0組裝(B.floridae v2.0assembly)中檢索的序列列出作為分別對應蛋白模型id’ S104514和104513的Bf-FF-1和FF-3。旋毛形線蟲(Tsp FF-1)和圓形線蟲(Ppa FF-1)對應 PpaFreezel.bases 數(shù)據(jù)庫的 gi 1162730680和Contig235.2。檢索尾刺耐格里原蟲的序列(Ngr-FF-1)對應gi | 284087402 (表4)。在表4中列出不同序列的登錄號/數(shù)據(jù)庫標識符。按照之前描述進行注解注(2)。圖6B顯示FF蛋白的多重序列比對的示意圖。顯示保守序列基序的序列比對。比對(顏色)代碼根據(jù)Jalview軟件(16)中具有40%保護顏色增量的Clustal X配色方案。圖6C顯示基于FF蛋白的多重序列比對的AFF-1的二級結構預測的示意圖。共有預測被顯示-將α-螺旋標記為管(由紅色管最初代表)，并標記β折疊為箭(由綠色箭最初代表)。
[0064]圖7A-D-來自圓形線蟲的FF-1蛋白能夠融合秀麗隱桿線蟲細胞。從圓形線蟲的基因組DNA中PCR擴增基因Ppa-ff-Ι (表2)并克隆至來自秀麗隱桿線蟲的熱休克啟動子(hspl6.2)的下游。使用野生型品系(N2)的顯微注射產生轉基因蠕蟲并與eff-1 (okl021)雜交(8)。通過使用共聚焦Z系列重建(2，8)的頂端接合標記從融合膜(AJM-1::GFP)消失之后可視化異位細胞融合(n=9胚胎)。圖7A-D顯示轉基因蠕蟲的異位細胞融合的象形圖(圖7A-B是熒光圖像，圖7C是明場且圖7D是圖7B和7C的圖像的合并)。1.5倍期胚胎，前左和腹下。異位細胞融合的效果是致死的。比例尺為ΙΟμπι。圖7Α顯示野生型胚胎，兩個背側皮下細胞進行正常的融合(由星號代表)。未融合的接合用箭標記。圖7B-D-熱休克后表達hsp::Ppa-ff-l(SEQ ID NO: 20)的eff-1突變體胚胎。個體細胞之間的頂端接合的消失表明Ppa-FF-1介導皮下細胞以eff-Ι獨立的方式融合。
[0065]圖8A-B顯示預測的AFF-1與II類病毒促融合劑的結構同源性的圖解模型。圖8A-上部:登革2包膜糖蛋白E(登錄:G1:34811077/8)的模型。顯示以下域:(登革2E蛋白的解析的結構(PDB:loke)的域 II (代表粉紅色)、域I (代表灰色)、域III (代表黃色))。底部(方框框住)-AFF-1推定的融 合環(huán)(“融合環(huán)”)和ij環(huán)(“ jl環(huán)”)的模型。
[0066]圖8B- (B)登革2E蛋白和AFF-1的預測的二級結構的結構比對。通過在文本之上的線指示融合環(huán)和ij環(huán)。比對顏色根據(jù)Clustal X的配色方案。β折疊-文本下面的方框和黑色箭；α-螺旋-文本下面的方框和黑色線。背景:域II ((代表粉紅色)、由“II”指示)、域I ((代表灰色)、由“I”指示)、域III ((代表黃色)、由“III”指示)。
[0067]發(fā)明詳述
[0068]定義
[0069]為便于本發(fā)明的理解，在下面定義了一些術語和短語。將被理解的是，這些術語和短語是用于描述的且不是限制的目的，以致本說明書的術語或用語將由本領域技術人員根據(jù)本文呈現(xiàn)的教導和指導，并聯(lián)合本領域普通技術人員的知識解讀。
[0070]術語“構建體”，如本文所用的，指的是可包括一種或多種核酸序列的人工組裝的或分離的核酸分子，其中核酸序列可包括編碼序列(即編碼終產物的序列)、調節(jié)序列、非編碼序列、或其任何組合。術語構建體包括，例如，載體，但不應被視為限于載體。
[0071]“表達載體”指的是在外源細胞中具有并入和表達異源核酸片段(諸如，例如，DNA)的能力的構建體。換句話說，表達載體包括能夠被轉錄的核酸序列/片段(諸如DNA、mRNA、tRNA、rRNA)。許多原核和真核表達載體是已知的和/或商業(yè)上可得的。合適的表達載體的選擇在具有本領域技術的人員的知識之內。
[0072]術語“表達”，如本文所用的，指的是所需終產物分子在靶細胞中的產生。終產物分子可包括，例如RNA分子；肽或蛋白；病毒；和類似的分子；或其組合。
[0073]如本文所用的，術語“引入”和“轉染”可互換地被使用且指的是分子諸如，例如，核酸、多核苷酸分子、載體、和類似的分子轉移進入靶細胞，且更具體地進入靶細胞的膜封閉空間的內部?？赏ㄟ^本領域技術人員已知的任何方式將分子“引入”至靶細胞內，例如根據(jù) Sambrook 等人 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York(2001)的教導，其內容通過引用并入本文?！耙搿狈肿又良毎麅鹊姆绞桨?，例如，但不限于:熱激、磷酸鈣轉染、PEI轉染、電穿孔、脂質轉染、轉染試劑、病毒介導的轉移、和類似的方式、或其組合。細胞轉染可對任何類型、任何來源的細胞進行，諸如，例如，人細胞、動物細胞、植物細胞、病毒、線蟲細胞、干細胞、腫瘤細胞、和類似的細胞。細胞可選自經(jīng)分離的細胞、組織培養(yǎng)細胞、細胞系、存在于生物體機體內的細胞、和類似的細胞。
[0074]如本文提到的，術語“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、及“核苷酸”在本文可互換地被使用。該術語是指脫氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)的多聚物及其被修飾的形式，以分離的片段的形式、或作為較大的構建體的組成部分、線性的或分支的、單鏈、雙鏈、三鏈、或其雜合體形式。該術語還包括RNA/DNA雜合體。多核苷酸可包括DNA或RNA的有義和反義寡核苷酸或多核苷酸序列。DNA或RNA分子可以是，例如，但不限于:互補DNA (cDNA)、基因組DNA、合成DNA、重組DNA、或其雜合體或RNA分子諸如，例如，mRNA、tRNA、shRNA、siRNA、miRNA、和類似的RNA分子。該術語還包括由天然存在的堿基、糖、和共價的核苷間鍵組成的寡核苷酸，以及具有與各自的天然存在的部分行使相似功能的非天然存在部分的寡核苷酸。
[0075]術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互換地被使用，指的是氨基酸殘基的聚合物。該術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是對應天然存在的氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物，和天然存在的氨基酸聚合物。
[0076]如本文所用的術語“同源性”、“同源的”和“同源物”是指肽的不同序列或核酸的不同序列之間的序列相似性。例如，如果兩個或多個蛋白具有高度相似的氨基酸序列，很可能它們是同源物。在一些實施方案中，同源物可包括種內、種間和/或門間的同源物。在一些實施方案中，術語同源物包括直向同源物和/或旁系同源物。
[0077]如本文提到的，術語“外源基因”是指從外部引入細胞內的基因(或其任一部分)。在一些實施方案中，外源基因以多核苷酸的形式(例如，DNA、RNA、和類似的形式)插入，例如，以表達載體的形式。在一些實施方案中，外源基因能夠在細胞中表達。在一些實施方案中，外源基因在細胞內過表達。
[0078]如本文提到的，關于細胞/細胞群體/生物體的術語“殺死”是指包括將導致該細胞/細胞群體/生物體死亡的任何類型的操作。
[0079]如本文所用的術語“治療(treating)”和“治療(treatment)”指的是降低癥狀的嚴重程度和/或頻率、消除癥狀和/或根本原因、預防癥狀的發(fā)生和/或它們的根本原因、及改善或補救損害。因此，例如，“治療(treating)”受試對象包括特定疾病、或敏感受試對象中的感染或不良生理事件的預防和臨床癥狀的受試對象的治療。
[0080]如本文提到的，術語“打蟲藥(anthelmintic)”或“抗螺蟲藥(antihelminthic)”或“抗線蟲藥(ant1-nematode)”可互換地被使用。該術語是指針對寄生蟲(寄生線性動物類或線蟲類)的劑/組合物。劑/組合物可包括多種分子，諸如，例如，但不限于:化學化合物、藥物、核酸分子(諸如，例如，DNA、RNA、siRNA、核酶、被修飾的核酸和類似物)、蛋白或肽(諸如，例如，酶、抗體、和類似物)、毒素或其組合。在不同的實施方案中，抗蠕蟲藥可被用于頓抑寄生蟲細胞、抑制/壓制寄生蟲細胞的生長、和/或殺死寄生蟲細胞。在一些實施方案中，術語“抗線蟲藥”指的是針對線蟲的抗蠕蟲藥。在一些實施方案中，術語抗蠕蟲藥和抗線蟲藥可互換地被使用。在一些實施方案中，抗線蟲藥是殺線蟲的(即能夠殺死線蟲/線蟲細胞的劑)。在一些實施方案中，抗線蟲藥是抑制線蟲的(即能夠頓抑/抑制/壓制線蟲/線蟲細胞的生長)。
[0081]如本文提到的，術語“融合蛋白”、“促融合劑(fusogen)”和“促融合蛋白(fusogenic protein)”可互換地被使用。術語是指能夠誘導/介導細胞與細胞例如通過細胞的脂質雙分子層的融合而融合的蛋白/多肽。在一些實施方案中，促融合蛋白是內源蛋白(即，由細胞的可靠的基因組編碼并通常由未被修飾的細胞表達的蛋白)。在一些實施方案中，促融合蛋白是外源蛋白(即，由引入至細胞內的外源基因編碼的蛋白)。在一些實施方案中，促融合蛋白包括全長促融合蛋白的部分/域。促融合蛋白的部分可以是促融合部分的任何域或此類域的組合，諸如，例如，信號肽(SP)域；前域；TGFi3-R1-樣域；“ [LMF]-G-W-[YFL]-[RK]基序”域；推定的蛋白-蛋白互作域；膜近端干域、跨膜域(TM)、融合環(huán)、和類似物，或源自促融合蛋白序列的任何所需肽。
[0082]如本文提到的，術語“FF蛋白”是指融合家族蛋白。術語“CeFF蛋白”是指秀麗隱桿線蟲起源的FF蛋白。FF蛋白的成員包括，例如，AFF-1和/或EFF-1蛋白和其同源物。其中所述線蟲起源的促融合蛋白，其意味著包括融合家族(FF)蛋白的成員和其同源物，其中同源物可包括種內、種間和/或門間的同源物。在一些實施方案中，術語“同源物”包括直向同源物和/或旁系同源物。如本文提到的，F(xiàn)F家族蛋白的同源物是共享包括I型膜糖蛋白的胞外域(ectodomain)中半胱氨酸的模式(pattern)的一級和/或二級氨基酸序列特征的蛋白。為考慮與FF家族的成員關系，候選蛋白與已知FF或相關的二級或三級結構(如圖6A-C中進一步顯示的)的蛋白共享至少15%的同一性或相似性。在一些實施方案中，F(xiàn)F蛋白可選自本文以下表4中列出的任何FF蛋白。在一些示例性的實施方案中，F(xiàn)F蛋白可選自，但不限于:CeAFF-1 (SEQ ID NO: 23)、Ce-EFF-1 (SEQ IS NO: 24)、tsp-FF-1(SEQ.1D.NO:25)、Bfl-FF-1 (SEQ ID NO:26),CeEFF-2,Cbr-aff-1,Cbr-eff-1,Cre-aff-1,Cre-eff-U Cs5_AFF_l、Cs5_EFF_l、Cs7/9_AFF_1、Cs7/9_EFF_1、Csll-FF, Ppa-FF-UPpa_FF_2、Ppa_FF_3、Pen-FF-1> Pma-FF-1> Tsp-ff-2、Tps_FF、Tpa_FF、Min_FF、Mar-FF>Mha-FF、Gpa-FF、Gpa-FFA、Gpa-FFB、Aca-FF、Bma-FF-1、Hco-FF、Asu-FF、Ot1-FF、Ot1-EFF-1、Dim-FF、Hao-FF, Ls1-FF-U Ls1-FF-2、Hgl-FF, Tmu-FF-U Tmu-FF-2、Sra-FF-U Sra-FF-2、Sra-FF-3、Ovo-FF、Tc1-FF,Wba-FF,Llo-FF,Bfl-FF-3、Pp1-FF、Cf1-FF,Lsa-FF,Ngr-FF-1、Ngr-FF-2、Ngr-FF-3、Ngr-FF-4、Bxy-FF-1、Bxy-FF-2、Can-FF、Hba-FF-1、Hba-FF-2、Rcu-FF、Hpo-FF, Ana-FF-1、Ana_FF_2、Mle-FF-1A、Mle-FF-1B、Mle-FF-2、Me 1-FF-3, Mel-FF-4、Mel-FF-5、Mel-FF-6或其任何組合。每一種可能性是一個單獨的實施方案。
[0083]如本文所用的，術語“假型病毒”指的是病毒中內源病毒包膜蛋白已被來自其他來源諸如，例如，來自其他病毒的包膜蛋白，被外源蛋白或肽(例如，線蟲起源的外源蛋白或妝)等等取代的病毒。
[0084]如本文提到的，術語“病毒細胞”意味著包括病毒、病毒顆粒、病毒包膜、病毒載體和/或假型病毒。
[0085]如本文所用的，術語“禿病毒(bald virus)”指的是缺少一種或多種病毒包膜蛋白的包膜病毒顆?；蚣俨《绢w粒。
[0086]如本文所用的，關于融合的術語“同型的”是指在表達相同融合蛋白的細胞、或表達相同家族的促融合蛋白的細胞之間的融合。
[0087]如本文所用的，術語“非昆蟲細胞”是指包括非昆蟲起源的細胞。術語包括，例如，此類細胞如哺乳動物細胞、鳥類細胞、植物細胞、病毒顆粒、人細胞、動物細胞和類似細胞。
[0088]如本文提到的，其中通過名稱提及的關于圖片的顏色(例如，“紅色”、“青色”、“紫色”、“綠色”、“粉紅色”、“黃色”、等)，它指的是當在色標中重現(xiàn)時能夠在圖片中鑒定的顏色。在適用的情況下、及如附圖簡述中顯示的，在提及顏色的情況下，它由標識符進一步指示，諸如，箭(實線、虛線、長虛線箭頭、和類似物)、星號、方框、數(shù)值的或任何其他指示。以彩色重現(xiàn)的原始圖片可在由本申請的一些發(fā)明人的出版物中發(fā)現(xiàn)(Avinoam,等人(19),其內容全文通過引用并入本文。
[0089]根據(jù)一些實施方案，且如本文示例的，F(xiàn)F家族的線蟲促融合蛋白和其同源物，諸如例如，CeFF蛋白，當FF蛋白在病毒和細胞的膜上表達和存在時可以能夠介導病毒與細胞(諸如，例如，哺乳動物細胞)的融合。在一些實施方案中，由病毒表達的FF蛋白取代病毒的內源促融合蛋白。在一些實施方案中，由病毒表達的促融合蛋白與由細胞表達的促融合蛋白是相同的促融合蛋白。在一些實施方案中，由病毒表達的促融合蛋白與由細胞表達的促融合蛋白不是相同的促融合蛋白，而是其家族成員。例如，由病毒和細胞兩者表達的促融合蛋白是AFF-1蛋白或其同源物。例如，如以下進一步顯示的，由病毒表達的融合蛋白是AFF-1而由細胞表達的融合蛋白則是EFF-1，且反之亦然。因此，在一些實施方案中，，線蟲促融合蛋白可取代內源病毒促融合劑作為最小促融合機制(machinery)。而且，病毒的感染生物學可從其中內源病毒促融合劑(例如，VSVG)僅在病毒中被需要的機制轉化為其中促融合劑在病毒和靶細胞的膜中表達的同型、依賴融合蛋白的作用方式。
[0090]根據(jù)一些實施方案，融合家族蛋白可以是可具有線蟲起源的、或甚至其他門的，諸如，例如脊索動物門的促融合蛋白家族的任何成員。序列比較(參考文獻4和本文)鑒定了在35個線蟲種中的推定的FF成員，表明FF家族在線蟲動物門中是保守的(4)。另外，相似的蛋白在節(jié)肢動物飛馬哲水蚤(Calanus finmarchicus)和鮭瘡痂魚風(Lepeophtheirussalmonis)(甲殼綱)、柿水母動物帽狀側腕水母(Pleurobrachia piIeus)、脊索動物佛州文昌魚(Branchiostoma floridae)(文昌魚目)和原生動物尾刺耐格里原蟲(Naegleriagruberi),(如在圖4A和以下表4中顯示的)中發(fā)現(xiàn)，表明FF蛋白在至少四種動物門和一種原生動物中是保守的。全部和部分FF序列的系統(tǒng)發(fā)生分析顯示可將FF蛋白分類成三個亞組(EFF-1-樣、AFF-1-樣和FF ;圖4A)。為進一步表征FF蛋白的分子保守，產生多重序列比對(圖6A)并確定FF蛋白共享推定的保守域的共同結構(圖6B)。例如，F(xiàn)F蛋白共享TGFb-R1-樣域(圖6A-C中的域III)中半胱氨酸的模式，表明它們在蛋白結構的水平是保守的。如圖6C中顯示的，二級結構預測顯示它們可能屬于“主要為β折疊超家族”家族。另外，如下文進一步顯示的，Hidden Markov模型的序列結構分析和比較表明FF蛋白可折疊以與來自α和黃曲霉病毒的II類促融合劑類似。
[0091]根據(jù)一些實施方案，且如以下進一步說明的，F(xiàn)F蛋白是在種之間且甚至在線蟲門之外可以是可互換的線蟲中的膜促融合劑的家族并因此當在那些細胞的膜上表達時家族的同源物可被用于細胞的融合。如下文示例的(例如，在圖4中)，當被細胞表達時，CeFF蛋白的不同的同源物(諸如，例如，旋毛形線蟲的線蟲種的Tsp-FF-Ι、來自線蟲圓形線蟲的EFF-1同源物和脊索動物門的脊索動物佛州文昌魚(Bfl-ff-Ι))能夠融合細胞。
[0092]根據(jù)一些實施方案，線蟲起源的融合家族蛋白和其同源物能夠在沒有另外的膜輔助因子的情況下介導病毒和細胞的同型或異型融合。病毒和細胞的融合導致細胞被病毒感染。
[0093]根據(jù)其他實施方案，線蟲起源的融合家族蛋白和其同源物能夠介導兩個細胞(第一細胞和第二細胞)的同型融合，其中細胞表達線蟲起源的促融合蛋白。在一些實施方案中，細胞是非昆蟲細胞。在一些實施方案中，至少一個被融合的細胞不是昆蟲細胞。每一種可能性是一個單獨的實施方案。
[0094]根據(jù)一些實施方案，線蟲可以是任何類型的線蟲。例如，線蟲可選自，但不限于:秀 I? 隱桿線蟲、秀 I? 小桿線蟲、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramane1、Caenorhabditis brenner1、廣桿屬線蟲種5、7、9、11、旋毛形線蟲、偽旋毛形線蟲、巴布亞旋毛蟲、Pristionchus entomophagus、Pristionchus maupas1、圓形線蟲、南方根結線蟲、花生根結線蟲、北方根結線蟲、馬鈴薯白線蟲、犬鉤口線蟲、馬來布魯線蟲、捻轉血茅線蟲、豬蛔蟲、Oscheius tipulae、犬惡絲蟲、Howardula aoronymphium、棉鼠絲蟲、大豆胞囊線蟲、食蚊羅曼索線蟲、鼠鞭蟲、鼠類圓線蟲、旋盤尾絲蟲、環(huán)紋背帶線蟲、班氏吳策線蟲、羅阿絲蟲、和本領域已知的任何其他線 蟲。每一種可能性是一個單獨的實施方案。
[0095]根據(jù)一些實施方案，為了在細胞中表達外源促融合蛋白，該細胞可被引入構建體，諸如，例如，編碼所需融合蛋白的合適的表達載體。編碼促融合蛋白的構建體可包括質粒、載體、病毒構建體、或其他本領域已知的構建體，用于在合適的靶細胞(其可包括，例如，哺乳動物細胞、鳥類細胞、植物細胞、病毒、和類似的細胞)中復制和表達。構建體可被用于細胞的瞬時轉染和/或穩(wěn)定轉染。促融合蛋白在靶細胞中的表達可由本領域已知的任何啟動子調節(jié)。此類啟動子可以是誘導型的或組成型的。此類啟動子包括，例如，但不限于:SV40早期啟動子區(qū)域、包含在魯斯氏肉瘤(Rous sarcoma)病毒的3’長末端重復中的啟動子、皰疹胸苷激酶啟動子、金屬硫蛋白基因的調節(jié)序列、病毒CMV啟動子、人絨毛膜促性腺激素β啟動子、和類似啟動子。通過本領域已知的任何方法，任何類型的質粒、粘粒、YAC或病毒載體都可被用于制備能夠被直接引入細胞內的構建體?？蛇x地，當靶細胞不是病毒時，病毒載體可被使用選擇性地感染所需的靶細胞。在一些實施方案中，促融合蛋白在細胞中的表達是瞬時的。在其他實施方案中，促融合蛋白在細胞中的表達是長期的。在一些實施方案中，促融合蛋白在細胞中的表達可以是可誘導的(即，促融合蛋白只在某些條件下表達)。
[0096]根據(jù)一些實施方案，因此提供了用于特定的、蛋白介導的病毒與細胞融合的方法，其中該病毒和該細胞表達線蟲家族的促融合蛋白、或其同源物。該方法包括放置/孵育/混合極為貼近的病毒和細胞，因此允許促融合蛋白的互作，其因此可導致細胞的融合。根據(jù)一些實施方案，促融合蛋白選自AFF-UEFF-1和其同源物。在一些示例性的實施方案中，促融合蛋白是CeFF蛋白。在一些實施方案中，相同的促融合蛋白在病毒和細胞的表面表達。在一些實施方案中，每一個病毒和細胞表達不同的促融合蛋白，兩個促融合蛋白都屬于融合家族蛋白的家族。在一些實施方案中，對于至少一個細胞，促融合蛋白是外源蛋白。該方法可在體外和/或體內被執(zhí)行。當在體外被執(zhí)行時，可將病毒和細胞放置在相同的生長培養(yǎng)基中并在允許細胞生長的有利條件下孵育。
[0097]根據(jù)一些實施方案，還提供了用于線蟲細胞和表達線蟲起源的外源促融合蛋白的病毒的靶向和特定融合的方法，其中由病毒表達的外源促融合蛋白取代可被病毒表達的內源促融合蛋白。
[0098]在一些實施方案中，表達線蟲起源的外源促融合蛋白的病毒可以是能夠與其他細胞融合的任何類型的病毒。在一些實施方案中，天然(未被修飾)病毒可以能夠憑借由未修飾的病毒表達的內源促融合蛋白誘導融合。例如，但不限制，病毒可以是逆轉錄病毒科的(例如HIV、MLV);嗜肝DNA病毒、痘病毒、彈狀病毒科病毒(例如，水泡性口炎病毒(VSV));副粘病毒；皰疹病毒；冠狀病毒、和類似病毒，或其組合。
[0099]根據(jù)另外的實施方案，因此提供了用于靶向殺死或抑制線蟲/線蟲細胞的方法，該方法包括將線蟲與表達線蟲起源的外源促融合蛋白的病毒接觸，因此允許病毒與線蟲細胞的融合。病毒和線蟲細胞之間融合的結果，病毒可誘導線蟲/線蟲細胞的溶解和/或抑制線蟲/線蟲細胞的生長。如果其太多的細胞被殺死，線蟲可進一步變得無活力。
[0100]根據(jù)另外的實施方案，提供了用于特定的、蛋白介導的、細胞與細胞融合的方法。該方法包括讓細胞在它們的膜上表達促融合蛋白并極其貼近地混合/放置/孵育細胞，因此允許可導致細胞融合的促融合蛋白的互作。介導融合的蛋白可以是線蟲起源的促融合蛋白或其同源物，并在細胞表面表達從而允許細胞的融合。根據(jù)一些實施方案，促融合蛋白選自AFF-UEFF-1和其同源物。在一些實施方案中，促融合蛋白是CeFF蛋白。在一些實施方案中，相同的促融合蛋白在兩種細胞的表面表達。在一些實施方案中，每一種細胞表達不同的融合蛋白，兩種促融合蛋白都屬于融合家族蛋白的家族。在一些實施方案中，促融合蛋白是內源表達的蛋白。在一些實施方案中，對于至少一種細胞，促融合蛋白是外源蛋白。在一些實施方案中，細胞具有相似的起源。在一些實施方案中，細胞具有不同的起源。例如，細胞可以是人起源的、動物起源的、植物起源的、鳥類起源的、和類似起源的。在一些示例性的實施方案中，兩種細胞(即，第一細胞和第二細胞)都表達外源Ce-AFF-1蛋白。在一些示例性的實施方案中，兩種細胞(即，第一細胞和第二細胞)都表達外源Ce-EFF-1蛋白。在一些實施方案中，第一細胞表達外源Ce-AFF-1蛋白且第二細胞表達Ce-EFF-1蛋白。在一些實施方案中，當細胞(即第一細胞和第二細胞)融合時，且形成雜交細胞。在一些實施方案中，雜交細胞包含兩個細胞核。
[0101]根據(jù)另外的實施方案，用于特定的、蛋白介導的、細胞與細胞融合的方法，可被用于將抗線蟲劑特定靶向至線蟲。在此類實施方案中，線蟲細胞與外源細胞的融合依賴于線蟲起源的促融合蛋白(或其同源物)在兩個融合細胞的膜中的表達，其中促融合蛋白可以是相同的或不同的。在一些示例性的實施方案中，一個細胞是線蟲起源的(內源表達融合蛋白)且第二細胞具有不同/外部起源(諸如，例如，病毒起源、植物起源、哺乳動物起源、鳥類起源、昆蟲起源)，其中第二細胞外源表達線蟲起源的促融合蛋白。第二細胞可包括一種或多種可包括任何本領域已知的或將來待研制/鑒定的抗線蟲劑的抗線蟲劑。被包含在細胞中的抗線蟲劑還可在細胞內的攜載體(carrier)中攜帶,其中攜載體被配置以在細胞內保護該劑。攜載體可包括，例如，此類攜載體如，脂質體、液泡、膠囊、微球、膠束、和類似物。在一些實施方案中，抗線蟲劑可由細胞編碼/產生。當細胞特異性融合時，抗線蟲劑可被釋放/表達并對線蟲發(fā)揮作用。作用可以是，例如，殺死、頓抑、和/或抑制/壓制線蟲的生長。
[0102]根據(jù)一些示例性的實施方案，抗線蟲劑可選自，但不限于:化學化合物(諸如，例如，但不限于:有機磷酸酯、氨基甲酸鹽、咪唑衍生物諸如，例如，苯并咪唑、左旋咪唑、殺線蟲熏劑、大環(huán)內酯類、除蟲菌素、密比霉素和類似物)；核酸(諸如，例如，針對線蟲基因的反義DNA分子；針對線蟲基因的siRNA分子、和類似物)；蛋白(諸如，例如，但不限于:能夠裂解線蟲蛋白的酶、針對線蟲蛋白的抗體)；毒素、抗體和其組合。
[0103]根據(jù)另外的實施方案，用于特定、蛋白介導的、細胞與細胞融合的方法可因此被用于多種生物體(諸如，例如，動物和人)和植物的寄生線蟲感染的治療。在一些實施方案中，方法可包括誘導待被治療的生物體/植物的一個或多個細胞表達線蟲起源的促融合蛋白和抗線蟲劑，據(jù)此當促融合蛋白被細胞表達時，感染生物體或植物的線蟲被融合至所述表達融合蛋白的細胞，因此將線蟲暴露于抗線蟲劑。
[0104]在一些實施方案中，提供了轉基因植物，其中至少一些植物細胞已被修飾以表達線蟲家族的促融合蛋白且任選地進一步表達抗線蟲劑(諸如，例如具有抗線蟲作用的蛋白或肽、能夠發(fā)揮抗線蟲作用的核酸序列、和類似物)。當用線蟲感染轉基因植物時，線蟲細胞將與表達促融合蛋白的植物細胞融合，且由那些細胞包含/編碼的抗線蟲劑可對線蟲發(fā)揮有害作用，諸如，例如，殺死線蟲和/或抑制/壓制其生長。在一些實施方案中，植物細胞表達線蟲促融合蛋白是組成型的(即，細胞持續(xù)地表達線蟲融合蛋白)。在一些實施方案中，植物細胞表達線蟲促融合蛋白是在不同條件下被誘導的(諸如，例如，不同的光照條件、不同的水分條件、不同的溫度、不 同的濕度、等等，或其組合)。
[0105]根據(jù)一些實施方案，線蟲促融合蛋白在植物中的穩(wěn)定或瞬時表達可通過用編碼線蟲促融合蛋白的核酸穩(wěn)定或瞬時轉染植物細胞獲得。在穩(wěn)定轉化中，編碼線蟲促融合蛋白的核酸分子整合至植物基因組中，且正因如此它代表了穩(wěn)定的并遺傳的性狀。在瞬時轉化中，核酸分子由被轉化的細胞表達但不整合至基因組，且正因如此代表了瞬時的性狀。
[0106]有將外源基因引入單子葉和雙子葉植物內的多種方法。外源DNA穩(wěn)定整合至植物基因組DNA的主要方法包括兩個主要方法:(i)農桿菌介導的基因轉移，其包括包含確定的整合至植物基因組DNA中的DNA區(qū)段的質粒載體的使用。植物組織的接種方法取決于植物種類和農桿菌遞送系統(tǒng)而不同。廣泛使用的方法是葉盤方法，其可用任何提供用于整個植株分化開始的好的來源的組織外植體被執(zhí)行。補充的方法采用農桿菌遞送系統(tǒng)與真空滲透組合。農桿菌系統(tǒng)在轉基因雙子葉植物的創(chuàng)建中尤其有用。(ii)DNA的直接吸收。有多種DNA直接轉移至植物細胞內的方法。在電穿孔中，原生質體短暫暴露于強電場，開放小空隙以允許DNA進入。在顯微注射中，使用微量加液器將DNA直接機械注入細胞內。在微粒轟擊中，DNA被吸附在微粒上，諸如硫酸鎂晶體或鎢顆粒，且微粒被物理加速進入細胞或植物組織。
[0107]在穩(wěn)定轉化之后，隨后發(fā)生植物繁殖。植物繁殖的最常用的方法是通過種子。再生轉化植物的另外的方法是通過微繁殖，其提供了被轉化的植物的快速、一致的繁殖。
[0108]瞬時轉化，例如，葉片細胞、分生細胞、或整個植株的瞬時轉化同樣可被使用。[0109]瞬時轉化可通過以上描述的任何DNA直接轉移的方法或通過使用經(jīng)修飾的植物病毒的病毒感染實施。
[0110]可用于植物宿主的轉化的病毒包括，例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)、煙草花葉病毒(TMV)、和桿狀病毒(BV)。在一些實施方案中，表達FF蛋白的假型BD病毒也可被用于遞送毒素、核酸和其他分子。
[0111]另外，編碼線蟲促融合蛋白的核酸分子還可被引入葉綠體基因組內。
[0112]根據(jù)另外的實施方案，治療生物體諸如哺乳動物、鳥類、嚙齒動物、和類似動物的寄生線蟲感染，可包括向被感染的生物體提供包括被遺傳改造以表達線蟲家族的外源促融合蛋白的病毒顆粒/病毒載體的組合物(諸如，例如，藥物組合物)。在一些實施方案中，病毒不表達內源促融合蛋白。在示例性的實施方案中，病毒內源蛋白被線蟲起源的促融合蛋白取代。組合物的病毒細胞/病毒載體不影響生物體的任何細胞，且在與線蟲細胞特定融合時，能夠誘導殺死或抑制線蟲的生長?？赏ㄟ^本領域任何已知的方法配制組合物，諸如，例如在s Pharmaceutical Sciences,，，Mack Publishing C0., Easton, PA 的最新一期中公開的，其通過引用全部并入本文。組合物還可包括一種或多種賦形劑，如本領域已知的。組合物可通過任何施用途徑被施用，諸如，例如，口服的、直腸的、經(jīng)粘膜的、尤其是經(jīng)鼻腔的、腸道的，或腸胃外遞送，包括肌內、皮下、和髓內注射，及鞘內、直接心室內、靜脈、腹腔、鼻腔、或眼內注射。在一些實施方案中，組合物被配制用于獸用用途。在一些實施方案中，組合物以病毒載體的形式，其中病毒載體的施用可通過，例如，靜脈或皮下注射進入生物體而執(zhí)行。在注射之后，病毒載體可循環(huán)直到它們識別線蟲細胞，據(jù)此它們病毒載體融合至線蟲細胞并誘導其致死或壓制其生長。
[0113]在一些實施方案中，被遺傳改造以表達線蟲家族的外源促融合蛋白的病毒細胞/病毒載體可整合至被治療的生物體的基因組中。
[0114]在一些實施方案中，提供了轉基因動物，其中至少一些細胞已被修飾以表達線蟲家族的促融合蛋白且任選地還表達抗線蟲劑(諸如，例如具有抗線蟲作用的蛋白或肽、能夠發(fā)揮抗線蟲作用的核酸序列、和類似物)。
[0115]根據(jù)一些實施方案，提供了用于治療受試對象中線蟲感染的方法，包括對受試對象施用包括表達線蟲家族的外源促融合蛋白的細胞的組合物，其中組合物的所述細胞和感染受試對象的線蟲細胞的融合可導致線蟲的死亡和/或抑制線蟲的生長，因此治療線蟲感染。在一些實施方案中，受試對象是人。在一些實施方案中，組合物是可通過本領域已知的任何方法被配制的藥物組合物。在示例性的實施方案中，組合物被配制以口服施用并在腸中釋放表達線蟲促融合蛋白的細胞。
[0116]在另外的實施方案中，提供了包括表達外源線蟲促融合蛋白的細胞和任選地抗線蟲劑的組合物用于治療有需要的受試者中的線蟲感染的用途。
[0117]根據(jù)一些實施方案，提供了用于治療動物中線蟲感染的方法，包括對動物施用包括表達線蟲家族的外源促融合蛋白的細胞的組合物，其中該組合物的所述細胞和線蟲細胞的融合可導致線蟲的死亡或抑制線蟲的生長，因此治療動物中的線蟲感染。在一些實施方案中，動物是嚙齒動物、哺乳動物、鳥類、等等。在一些示例性的實施方案中，動物是牛、雞、馬、犬、等等，或任何其他可能被線蟲感染的動物。
[0118]根據(jù)一些實施方案，還提供了用于線蟲促融合蛋白在病毒表面表達的病毒載體。促融合蛋白可選自AFF-UEFF-1和其同源物。
[0119]根據(jù)另外的實施方案，提供了表達線蟲起源的外源促融合蛋白的細胞，其中所述外源促融合蛋白是融合家族蛋白成員。細胞可以是任何起源的，諸如，例如，哺乳動物細胞、鳥類細胞、病毒細胞、植物細胞、人細胞、動物細胞、和類似細胞。在一些實施方案中，細胞是非昆蟲細胞。每一種可能性是一個單獨的實施方案。
[0120]在不同的實施方案中，還提供了用于實行不同實施方案的抗線蟲方法的試劑盒。試劑盒可包括，例如，至少以下的一種或多種:表達外源線蟲促融合蛋白的病毒；表達外源線蟲融合蛋白的細胞，其中該細胞可任選地表達抗線蟲劑；用于在細胞表面表達線蟲促融合蛋白的載體；和表達線蟲促融合蛋白的病毒載體。試劑盒還可包括另外的組分，諸如，例如，合適的容器、合適的生長培養(yǎng)基、緩沖液、試劑、和類似物。另外，試劑盒還可包括使用試劑盒的組分實行不同實施方案諸如，例如，用于線蟲感染的治療的說明書。
[0121]根據(jù)不同的實施方案，被強調的是其中所述線蟲起源的促融合蛋白，它還包含其同源物。在一些實施方案中，促融合蛋白包括任何具有與已知的FF或相關結構的蛋白至少15%的同一性或相似性的蛋白(例如，如圖6中顯示的)。
[0122]術語包含包括術語由......組成。
[0123]雖然已在上面論述了一些示例性的方面和實施方案，本領域技術人員將認識到某些修改、排列、添加和其亞組合。因此意圖是下面所附權利要求及此后引入的權利要求被解讀為包括所有此類修改、排列、添加和亞組合，因為在它們的實際精神和范圍之內。
[0124]呈現(xiàn)下面的實施例 為了更全面地闡述本發(fā)明的某些實施方案。然而，它們絕不應該被理解為限制本發(fā)明的寬范圍。本領域技術人員可容易地設想本文公開的原理的許多變化和修改，而不偏離本發(fā)明的范圍。
實施例
[0125]材料與方法
[0126]DNA構建體
[0127]關于FF 蛋白的瞬時表達，將 AFF-1::FLAG (SEQ ID NO:1)、EFF-1::V5 (SEQ IDNO: 2)、Tsp-FF-1::FLAG (SEQ ID NO: 3)、和 Bfl-FF-l::FLAG (SEQ ID NO:4)插入 pCAGGS哺乳動物表達載體(15)(表2和4)。除非另外指明，否則5’KpnI和3’NheI限制性酶切位點被用于克隆進入pCAGGS。為了產生p0A20 (表2)，使用引物0R55、0R56 (表3)PCR擴增? PIZT-AFF-1 (10)編碼的 DNA。為了產生 p0A19 (表 2)，使用引物 0R54、0R55 (表 3) PCR擴增由PIZT-EFF-1A (9)編碼的DNA。為了產生p0A35 (表2)，使用嵌套引物0R100-0R103(表3) PCR擴增來自cDNA文庫(從Nagano獲得)的DNA。將PCR產物連接進入由制造商(Promega)推薦的pGEMT-easy并隨后用作用引物ORlll和ORl 12 (表3) PCR擴增的模板。為產生P0A60 (表2)，將對應于登錄號gi I 210090015 |、具有側翼5’ Kpnl、3，NheI的cDNA序列優(yōu)化用于表達和合成(GeneScript)。為了標記細胞質，使用pRFPnes (16)。為了標記細胞核，使用編碼具有來自猿猴病毒大T抗原的細胞核定位信號(nls)的兩個串聯(lián)重復的 CFP 的 pCFPnls (SEQ ID N0.21)。為了產生 pCFPnls，使用引物 0R147-148 (表 3)，且pCH44 (16)作為模板。將 PCR 產物克隆進入 pCDNA3.1 ( + ) (Invitrogen)的 BamH1、EcoRI位點。為了產生P0A6，使用圓形線蟲基因組DNA (PS312)作為模板與引物0R-19和0R-22(表 3)。將 PCR 產物連接進入 pPD49.78。為了產生 pRSETA-AFFlEC (SEQ.1D.NO: 27)，使用弓丨物AM66和AM67 (表3)，且Ce-AFF-lcDNA作為模板(10)。將PCR產物克隆進入pRSET-A(Invitrogen)的BglI1、KpnI位點。所有序列都通過測序驗證。
[0128]表2-所用的質粒
[0129]
【權利要求】
1.一種組合物，所述組合物包括表達外源線蟲促融合蛋白的非昆蟲細胞或病毒顆粒。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中所述非昆蟲細胞選自哺乳動物細胞、鳥類細胞、 和植物細胞。
3.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中所述促融合蛋白能夠介導所述細胞或病毒顆粒與表達第二線蟲促融合蛋白的第二細胞的融合。
4.根據(jù)權利要求3所述的組合物，其中所述第二細胞選自外源表達第二線蟲促融合蛋白的哺乳動物細胞、鳥類細胞、和植物細胞，或內源表達線蟲促融合蛋白的線蟲細胞。
5.根據(jù)權利要求3所述的組合物，其中所述第二線蟲促融合蛋白與所述非昆蟲細胞的促融合劑是相同的或不同的。
6.一種用于融合第一細胞和第二細胞的方法，所述方法包括：將包括第一外源線蟲促融合蛋白的第一細胞與包括第二外源線蟲促融合蛋白的第二細胞一起孵育；因此融合所述第一細胞和所述第二細胞以形成融合的細胞，其中所述細胞中的至少一個不是昆蟲起源的。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述第一細胞和所述第二細胞具有相同的起源。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述第一細胞和所述第二細胞具有不同的起源。
9.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述細胞選自：病毒、植物、鳥類、動物、人、或其組合
10.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述第一促融合蛋白和所述第二促融合蛋白是相同的。
11.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述第一促融合蛋白和所述第二促融合蛋白是不同的。
12.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述第一促融合蛋白和所述第二促融合蛋白選自AFF-UEFF-I或其同源物。
13.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述第一外源線蟲促融合蛋白在所述第一細胞和/或所述第二細胞中的表達是瞬時的。
14.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述外源線蟲促融合蛋白在所述第一細胞和/或所述第二細胞中的表達是穩(wěn)定的。
15.一種抗線蟲組合物，所述抗線蟲組合物包括：包括外源線蟲融合蛋白的細胞，所述外源線蟲融合蛋白能夠介導所述細胞與線蟲細胞的融合；其中所述組合物誘導殺死所述線蟲或抑制所述線蟲的生長。
16.根據(jù)權利要求15所述的抗線蟲組合物，其中所述細胞選自哺乳動物細胞、鳥類細胞、植物細胞、和病毒。
17.根據(jù)權利要求16所述的抗線蟲組合物，其中所述病毒選自逆轉錄病毒、嗜肝DNA病毒、痕病毒、彈狀病毒科（Rhabdovir idae)、副粘病毒、抱疫病毒和冠狀病毒。
18.根據(jù)權利要求15所述的抗線蟲組合物，其中所述外源線蟲促融合蛋白選自AFF-1、 EFF-I和其同源物。
19.根據(jù)權利要求11所述的組合物，其中所述線蟲選自：秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans)、秀麗小桿線蟲（Caenorhabditis briggsae)、Caenorhabditis2japonica、Caenorhabditis ramanei、Caenorhabditis brenneri、廣桿屬線蟲種 5、7、9、.11(Caenorhabditis sp5, 7，9，11)、旋毛形線蟲（Trichinella spiralis)、偽旋毛形線蟲(Trichinella pseudospiralis)、巴布亞方定毛蟲（Trichinella papuae)、Pristionchusentomophagus、Pristionchus maupasi、圓形線蟲（Pristionchus pacificus)、南方根結線蟲（Meloidogyne incognita)、花生根結線蟲（Meloidogyne arenaria)、北方根結線蟲(Meloidogyne hapla)、馬鈴薯白線蟲（Globodera pallida)、犬鉤口線蟲(Ancylostomacaninum)、馬來布魯線蟲（Brugia Malayi )、搶轉血茅線蟲（Haemonchus contortus)、豬蟲回蟲（Ascaris suum)、Oscheius tipulae、犬惡絲蟲（Dirofilaria immitis)、Howardulaaoronymphium、棉鼠絲蟲（Litomosoides sigmodontis)、大豆胞囊線蟲（Heteroderaglycines)、食蚊羅曼索線蟲（Romanomermis culicivorax)、鼠鞭蟲（Trichuris muris)、鼠類圓線蟲（Strongyloids ratti)、旋盤尾絲蟲（Onchocerca volvulus)、環(huán)紋背帶線蟲(Teladorsagia circumcincta)、班氏吳策線蟲（Wuchereria bancrofti)、和羅阿絲蟲（LoaIoaX
20.根據(jù)權利要求15所述的組合物，其中所述外源線蟲促融合蛋白在所述細胞中瞬時表達。
21.根據(jù)權利要求15所述的組合物，其中所述外源線蟲促融合蛋白在所述細胞中穩(wěn)定表達。
22.根據(jù)權利要求15所述的組合物，其中所述細胞還包括抗線蟲劑。
23.根據(jù)權利要求22所述的組合物，其中所述抗線蟲劑選自化學物質、蛋白、核酸、毒素和其組合。
24.根據(jù)權利要求22所述的組合物，其中所述抗線蟲劑由所述細胞表達。
25.一種用于靶向殺死線蟲的方法，所述方法包括：將所述線蟲與包括外源線蟲促融合蛋白的病毒接觸，所述外源線蟲促融合蛋白能夠介導所述病毒與所述線蟲的細胞的融合； 據(jù)此所述融合導致殺死所述線蟲。
26.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中所述外源促融合蛋白是選自AFF-UEFF-I和其同源物的線蟲蛋白。
27.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中所述線蟲選自秀麗隱桿線蟲、秀麗小桿線蟲、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramanei、Caenorhabditis brenneri、廣桿屬線蟲種5、7、9、11、旋毛形線蟲、偽旋毛形線蟲、巴布亞旋毛蟲、Pristionchusentomophagus> Pristionchus maupasi、圓形線蟲、南方根結線蟲、花生根結線蟲、北方根結線蟲、馬鈴薯白線蟲、犬鉤口線蟲、馬來布魯線蟲、捻轉血茅線蟲、豬蛔蟲、Oscheiustipulae、犬惡絲蟲、Howardula aoronymphium、棉鼠絲蟲、大豆胞囊線蟲、食蚊羅曼索線蟲、鼠鞭蟲、鼠類圓線蟲、旋盤尾絲蟲、環(huán)紋背帶線蟲、班氏吳策線蟲、和羅阿絲蟲。
28.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中所述病毒選自逆轉錄病毒、嗜肝DNA病毒、痘病毒、彈狀病毒科病毒、副粘病毒、皰疫病毒和冠狀病毒。
29.一種用于靶向殺死線蟲的方法，所述方法包括：將所述線蟲與包括以下的細胞接觸： a.能夠介導所述細胞和所述線蟲的細胞融合的外源促融合蛋白；和b.抗線蟲劑； 據(jù)此所述融合誘導殺死所述線蟲。
30.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中所述細胞選自哺乳動物細胞、鳥類細胞、病毒、和植物細胞。
31.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中所述外源促融合蛋白是選自AFF-UEFF-I和其同源物的線蟲蛋白。
32.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中所述抗線蟲劑選自化學物質、蛋白、核酸、毒素和其組合。
33.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中所述抗線蟲劑由所述細胞表達。
34.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中所述線蟲選自：秀麗隱桿線蟲、秀麗小桿線蟲、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramanei、Caenorhabditis brenneri、廣桿屬線蟲種5、7、9、11、旋毛形線蟲、偽旋毛形線蟲、巴布亞旋毛蟲、Pristionchusentomophagus> Pristionchus maupasi、圓形線蟲、南方根結線蟲、花生根結線蟲、北方根結線蟲、馬鈴薯白線蟲、犬鉤口線蟲、馬來布魯線蟲、捻轉血茅線蟲、豬蛔蟲、Oscheiustipulae、犬惡絲蟲、Howardula aoronymphium、棉鼠絲蟲、大豆胞囊線蟲、食蚊羅曼索線蟲、鼠鞭蟲、鼠類圓線蟲、旋盤尾絲蟲、環(huán)紋背帶線蟲、班氏吳策線蟲、和羅阿絲蟲。
35.一種用于治療受試對象中線蟲感染的方法，所述方法包括對所述受試對象施用包括表達外源線蟲促融合蛋白的細胞或病毒的組合物； 其中所述細胞和感染所述受試對象的線蟲細胞的融合誘導所述線蟲的死亡或抑制所述線蟲的生長。
36.根據(jù)權利要求35所述的方法，其中所述受試對象是人。
37.根據(jù)權利要求35所述的方法，其中所述受試對象是動物。
38.根據(jù)權利要求35所述的方法，其中所述施用選自口服施用、注射、栓劑和局部施加。
39.根據(jù)權利要求35所述的方法，其中所述細胞還包括抗線蟲劑。
40.根據(jù)權利要求39所述的方法，其中所述抗線蟲劑選自化學物質、蛋白、核酸、毒素或其組合。
41.根據(jù)權利要求39所述的方法，其中所述細胞選自哺乳動物細胞、鳥類細胞、病毒、植物細胞、或其組合。
42.根據(jù)權利要求35所述的方法，其中所述外源促融合蛋白是選自AFF-UEFF-I和其同源物的線蟲蛋白。
43.—種病毒載體,所述病毒載體用于在病毒的表面表達線蟲促融合蛋白。
【文檔編號】C07K14/435GK103502270SQ201280016941
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年1月31日 優(yōu)先權日:2011年2月1日
【發(fā)明者】本杰明·珀德比勒維茨, 奧里·阿維諾姆, 朱迪思·M·懷特 申請人:技術研究及發(fā)展基金有限公司, 弗吉尼亞大學專利基金會