本發(fā)明屬于靶向納米載體制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種非固定形態(tài)殼層的納米載體。

背景技術(shù)：

在目前靶向稀土上轉(zhuǎn)換納米載體的制備領(lǐng)域中，核殼結(jié)構(gòu)是主要的納米載體構(gòu)建方式，但此結(jié)構(gòu)存在的問(wèn)題主要包括納米載體的殼層一般為固定形態(tài)，不易變形，如二氧化硅層等。納米載體的固定形態(tài)的殼層會(huì)增加納米載體在體內(nèi)應(yīng)用的尺寸效應(yīng)，降低體內(nèi)運(yùn)輸及組織吸收的柔韌性，增加對(duì)血管及體內(nèi)組織的摩擦傷害。同時(shí)，納米載體負(fù)載分子的方式通常為物理浸泡的方式，固定形態(tài)的殼層對(duì)負(fù)載分子的浸入量有限，分子的負(fù)載量隨殼層的加深而減少。負(fù)載分子與納米核心的距離限制了他們之間的能量傳遞作用，例如負(fù)載分子為光敏劑，距離會(huì)影響光敏劑分子與上轉(zhuǎn)換納米之間的能量共振轉(zhuǎn)移作用。因此，有必要提供一種非固定形態(tài)殼層的納米載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供非固定形態(tài)殼層的納米載體，即一種褶皺核殼結(jié)構(gòu)的納米載體，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明首先提供一種非固定形態(tài)殼層的納米載體，是在稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒的外表面上由內(nèi)到外依次包裹上二氧化硅層和3-氨基異丙基三甲氧基硅烷薄層APTMS；且3-氨基異丙基三甲氧基硅烷薄層上進(jìn)行了刻蝕處理；

上述的刻蝕處理，作為實(shí)施例的優(yōu)選，是使用NaOH溶液進(jìn)行的處理；

上述的非固定形態(tài)殼層的納米載體，其一種制備方法如下：

步驟1)：在稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNPs)(NaYF₄:Yb/Er)的表面連接二氧化硅層，獲得UCNPs@SiO₂核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒；

步驟2)：在步驟1)獲得的納米顆粒的表面包覆3-氨基異丙基三甲氧基硅烷APTMS薄層，獲得UCNPs@SiO₂@APTMS核殼納米顆粒；

步驟3)將步驟2)制備的核殼納米顆粒分散于NaOH溶液中，進(jìn)行攪拌刻蝕，獲得UCNPs為核心，薄層SiO₂@APTMS表面褶皺的核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米載體；

在一些實(shí)施例中，上述步驟1)的一種具體操作如下：

將上轉(zhuǎn)換納米顆粒分散于含有CO-520的環(huán)己烷溶液中，溶液進(jìn)行密封常溫旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)結(jié)束后向溶液中再加入CO-520和氨水，混合溶液進(jìn)行密封超聲直到溶液變澄清；再加入正硅酸乙酯(TEOs)制成混合溶液，混合溶液進(jìn)行密封常溫旋轉(zhuǎn)制成，再加入丙酮沉化獲得二氧化硅包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒，將二氧化硅包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒用和乙醇水溶液清洗后，再存于無(wú)水乙醇中；

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟2)的一種具體操作如下：

將二氧化硅包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒溶解在甲苯中，再加入APTMS制成混合溶液，混合溶液進(jìn)行密封常溫旋轉(zhuǎn)；旋轉(zhuǎn)結(jié)束后離心收集納米顆粒，用甲苯清洗風(fēng)干后獲得表面包覆有APTMS層且有氨基的UCNPs@SiO₂@APTMS核殼納米顆粒；

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟3)的一種具體操作如下：

將UCNPs@SiO₂@APTMS核殼納米顆粒分散于NaOH溶液中對(duì)SiO₂內(nèi)部進(jìn)行刻蝕，然后溶液進(jìn)行密封常溫旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)結(jié)束后離心收集，獲得UCNPs@薄層SiO₂/APTMS的褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體，并將其分散于水中。

本發(fā)明另一個(gè)方面提供上述表面褶皺的核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米載體在藥物負(fù)載中的應(yīng)用；

所述的應(yīng)用，是將UCNPs@薄層SiO₂/APTMS的褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體用于負(fù)載光敏劑分子或是熒光劑分子；

本發(fā)明再一個(gè)發(fā)明提供負(fù)載光敏劑分子或熒光劑分子，是用上述的具有褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體制備的；

其一種制備方法如下：

步驟1)將UCNPs@薄層SiO₂/APTMS的褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體浸入光敏劑分子溶液或是熒光分子溶液中，密閉進(jìn)行懸浮，物理吸附，然后離心收集納米顆粒，將顆粒清洗后存放于MES緩沖液中，獲得褶皺結(jié)構(gòu)中負(fù)載有光敏劑分子或是熒光分子的納米載體；

再將透明質(zhì)酸活化后加入MES緩沖液中，并加入步驟1)制備的負(fù)載有光敏劑分子或是熒光分子的褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體，溶液密封超聲室溫旋轉(zhuǎn)進(jìn)行酰胺化反應(yīng)制成產(chǎn)品。

本發(fā)明制備以透明質(zhì)酸為靶向，以薄層SiO₂/APTMS層為褶皺層，以上轉(zhuǎn)換納米顆粒為核心的褶皺核殼結(jié)構(gòu)的納米載體。褶皺層的高柔韌性，高表面積和與核心上轉(zhuǎn)換納米顆粒距離短等優(yōu)勢(shì)，可以有效負(fù)載光敏劑分子用于光動(dòng)力治療，或是熒光分子用于成像。

附圖說(shuō)明

圖1：具有腫瘤靶向的褶皺核殼結(jié)構(gòu)的納米載體的制備方法流程圖；

圖2：腫瘤靶向的褶皺核殼結(jié)構(gòu)的納米載體不同制備過(guò)程的透射電鏡圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1靶向的褶皺核殼結(jié)構(gòu)的納米載體的制備

1)將0.1mlCO-520加入到含有0.004M上轉(zhuǎn)換納米顆粒的環(huán)己烷中，攪拌10min。再加入0.4mlCO-520和0.08ml，28wt％的氨水，溶液密閉超聲20min，直到溶液變澄清。再加入0.04ml的TEOS，溶液密閉旋轉(zhuǎn)2天。旋轉(zhuǎn)結(jié)束后加丙酮沉化，用乙醇/水(v/v＝1:1)混合液清洗兩次后存于1.5ml無(wú)水乙醇中。

2)將溶于無(wú)水乙醇中UCNPs@SiO₂，10000rpm離心10min，倒掉上清液，加入1.5ml甲苯，震蕩5min，10000rpm離心10min，去掉上清液。將納米顆粒抽吸入含有4ml甲苯的小瓶中，150rpm旋轉(zhuǎn)6h。之后加入90ulAPTMS，溶液密閉室溫旋轉(zhuǎn)24h。旋轉(zhuǎn)結(jié)束后10000rpm離心10min。分別用4ml無(wú)水乙醇和超純水洗滌兩次，去掉上清液。獲得UCNPs@SiO2@APTMS核殼上轉(zhuǎn)換納米顆粒。

3)將步驟2)中制備的三層上轉(zhuǎn)換納米顆粒抽吸入5ml 0.07g/ml的NaOH溶液中，低速旋轉(zhuǎn)40min。旋轉(zhuǎn)結(jié)束后10000rpm離心5min，倒掉上清液。用超純水洗滌兩次，直到溶液PH呈中性。獲得UCNPs@薄層SiO₂/APTMS的褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體，并將其溶于MES緩沖液中。UCNPs@薄層SiO₂/APTMS的顆粒大小約為40nmx20nmx20nm，薄層SiO₂/APTMS的厚度約為2-3nm，因?yàn)楸尤彳浺仔巫?，形成褶皺之后有微多孔管道存在?/p>

4)在褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體表面修飾透明質(zhì)酸：

稱取15mg透明質(zhì)酸(HA)放入2ml超純水中活化過(guò)夜，再加入2ml MES緩沖液(緩沖液中EDC(4mg/ml)和NHS(4mg/ml))，保證EDC和NHS對(duì)透明質(zhì)酸的作用終濃度都為2mg/ml。溶液常溫600rpm旋轉(zhuǎn)30min。取2ml含有15mg納米顆粒的MES緩沖液加入上面的溶液中，溶液密封超聲40min后，室溫旋轉(zhuǎn)300rpm，8h，充分進(jìn)行酰胺化反應(yīng)。反應(yīng)完成后10000rpm離心10min離心收集產(chǎn)品，取2ml超純水吹打溶液直到顆?；靹颍芤撼蕬覞嵋?，離心收集納米顆粒，10000rpm離心10min。重復(fù)以上步驟，再次用2ml超純水清洗納米顆粒。納米顆粒清洗2次后完成生物光敏劑的制備。將產(chǎn)品存放于2ml超純水中，密封4℃保存。

實(shí)施例2靶向的褶皺核殼結(jié)構(gòu)的納米載體的制備

1)將0.1ml CO-520加入到含有0.01M上轉(zhuǎn)換納米顆粒的環(huán)己烷中，攪拌10min。再加入0.4ml CO-520和0.08ml，28wt％的氨水，溶液密閉超聲20min，直到溶液變澄清。再加入0.04ml的TEOS，溶液密閉旋轉(zhuǎn)2天。旋轉(zhuǎn)結(jié)束后加丙酮沉化，用乙醇/水(v/v＝1:1)混合液清洗兩次后存于1.5ml無(wú)水乙醇中。

2)將溶于無(wú)水乙醇中UCNPs@SiO₂，10000rpm離心10min，倒掉上清液，加入1.5ml甲苯，震蕩5min，10000rpm離心10min，去掉上清液。將納米顆粒抽吸入含有4ml甲苯的小瓶中，150rpm旋轉(zhuǎn)6h。之后加入120ul APTMS，溶液密閉室溫旋轉(zhuǎn)24h。旋轉(zhuǎn)結(jié)束后10000rpm離心10min。分別用4ml無(wú)水乙醇和超純水洗滌兩次，去掉上清液。獲得UCNPs@SiO₂@APTMS核殼上轉(zhuǎn)換納米顆粒。

3)將步驟2)中制備的三層上轉(zhuǎn)換納米顆粒抽吸入5ml 0.07g/ml的NaOH溶液中，低速旋轉(zhuǎn)90min。旋轉(zhuǎn)結(jié)束后10000rpm離心5min，倒掉上清液。用超純水洗滌兩次，直到溶液PH呈中性。獲得UCNPs@薄層SiO2/APTMS的褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體，并將其溶于MES緩沖液中。

4)在褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體表面修飾透明質(zhì)酸：

稱取15mg透明質(zhì)酸(HA)放入2ml超純水中活化過(guò)夜，再加入2ml MES緩沖液(緩沖液中EDC(4mg/ml)和NHS(4mg/ml))，保證EDC和NHS對(duì)透明質(zhì)酸的作用終濃度都為2mg/ml。溶液常溫600rpm旋轉(zhuǎn)30min。取2ml含有15mg納米顆粒的MES緩沖液加入上面的溶液中，溶液密封超聲40min后，室溫旋轉(zhuǎn)300rpm，8h，充分進(jìn)行酰胺化反應(yīng)。反應(yīng)完成后10000rpm離心10min離心收集產(chǎn)品，取2ml超純水吹打溶液直到顆粒混勻，溶液呈懸濁液，離心收集納米顆粒，10000rpm離心10min。重復(fù)以上步驟，再次用2ml超純水清洗納米顆粒。納米顆粒清洗2次后完成靶向分子的枝接。將產(chǎn)品存放于2ml超純水中，密封4℃保存，納米載體的水溶液分散均勻，呈泛白色的乳濁液。

實(shí)施例3應(yīng)用1UCNPs@薄層SiO2/APTMS的褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體負(fù)載光敏劑用于光動(dòng)力治療

1)稱取0.5mg酞菁二氯化鈦溶于3ml的吡啶溶液中，密封超聲40min。將將步驟3)中獲得的褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒浸入上清液中，密閉瓶口超聲40min之后，室溫600rpm旋轉(zhuǎn)24h。離心收集納米顆粒，3000rpm離心10min。吸取2ml PBS溶液(0.1M PH7.5)吹打溶液直到顆?；靹?，溶液呈懸濁液，再離心收集納米顆粒，3000rpm離心10min。重復(fù)以上步驟，再次用2mlPBS溶液清洗納米顆粒。最后顆粒存放于2ml MES緩沖液中。獲得負(fù)載有光敏劑酞菁二氯化鈦的納米顆粒

2)在褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體表面修飾透明質(zhì)酸：

稱取15mg透明質(zhì)酸(HA)放入2ml超純水中活化過(guò)夜，再加入2ml MES緩沖液(緩沖液中EDC(4mg/ml)和NHS(4mg/ml))，保證EDC和NHS對(duì)透明質(zhì)酸的作用終濃度都為2mg/ml。溶液常溫600rpm旋轉(zhuǎn)30min。取2ml含有15mg納米顆粒的MES緩沖液加入上面的溶液中，溶液密封超聲40min后，室溫旋轉(zhuǎn)300rpm，8h，充分進(jìn)行酰胺化反應(yīng)。反應(yīng)完成后10000rpm離心10min離心收集產(chǎn)品，取2ml超純水吹打溶液直到顆粒混勻，溶液呈懸濁液，離心收集納米顆粒，10000rpm離心10min。重復(fù)以上步驟，再次用2ml超純水清洗納米顆粒。納米顆粒清洗2次后完成生物光敏劑的制備。將產(chǎn)品存放于2ml超純水中，密封4℃保存。

獲得的靶向且具有表面褶皺的新型生物光敏劑，可用于深層組織的高效強(qiáng)靶向的光動(dòng)力治療。光的波長(zhǎng)越大，組織穿透能力越強(qiáng)，近紅外光可以到達(dá)組織深層。由于β-NaYF4:Yb/Er這種晶相的上轉(zhuǎn)換納米顆粒，可以吸收近紅外980nm的激光，而發(fā)射出520nm，540nm和653nm波長(zhǎng)的可見光。其上負(fù)載光敏劑，就可以實(shí)現(xiàn)深層組織的光動(dòng)力治療。

實(shí)施例4應(yīng)用2負(fù)載熒光劑用于組織深淺兩個(gè)層次的熒光成像

1)稱取0.5mg異硫氰酸熒光素(FITC)溶于5ml的水溶液中，密封超聲20min。將將步驟3)中獲得的褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒浸入上清液中，密閉瓶口超聲40min之后，室溫600rpm旋轉(zhuǎn)24h。離心收集納米顆粒，3000rpm離心10min。吸取2ml PBS溶液(0.1M PH7.5)吹打溶液直到顆?；靹颍芤撼蕬覞嵋?，再離心收集納米顆粒，3000rpm離心10min。重復(fù)以上步驟，再次用2mlPBS溶液清洗納米顆粒。最后顆粒存放于2ml MES緩沖液中。獲得褶皺結(jié)構(gòu)中負(fù)載有FITC熒光分子的納米載體。

2)在褶皺核殼結(jié)構(gòu)納米載體表面修飾透明質(zhì)酸：

稱取15mg透明質(zhì)酸(HA)放入2ml超純水中活化過(guò)夜，再加入2ml MES緩沖液(緩沖液中EDC(4mg/ml)和NHS(4mg/ml))，保證EDC和NHS對(duì)透明質(zhì)酸的作用終濃度都為2mg/ml。溶液常溫600rpm旋轉(zhuǎn)30min。取2ml含有15mg納米顆粒的MES緩沖液加入上面的溶液中，溶液密封超聲40min后，室溫旋轉(zhuǎn)300rpm，8h，充分進(jìn)行酰胺化反應(yīng)。反應(yīng)完成后10000rpm離心10min離心收集產(chǎn)品，取2ml超純水吹打溶液直到顆?；靹?，溶液呈懸濁液，離心收集納米顆粒，10000rpm離心10min。重復(fù)以上步驟，再次用2ml超純水清洗納米顆粒。納米顆粒清洗2次后完成生物光敏劑的制備。將產(chǎn)品存放于2ml超純水中，密封4℃保存。

獲得的靶向且具有表面褶皺的新型熒光劑，可以實(shí)現(xiàn)在深層組織和表面組織的熒光成像。FITC這種熒光分子負(fù)載到納米顆粒的褶皺結(jié)構(gòu)中，可以吸收490～495nm的短波長(zhǎng)的光子，發(fā)射出520～530nm的熒光。由于激發(fā)波長(zhǎng)較短，組織穿透能力較弱，可以完成淺層組織的成像。而稀土上轉(zhuǎn)換納米核心，可以吸收近紅外980nm的激光，而發(fā)射出520nm，540nm和653nm波長(zhǎng)的可見光，由于可以被近紅外光所激發(fā)，可以實(shí)現(xiàn)組織深層成像。