專利名稱：纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤的基因治療領(lǐng)域，具體涉及到一種纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體。
背景技術(shù)：
腫瘤目前是嚴(yán)重威脅人類生命健康的一大類疾病，通過常規(guī)治療手段難以徹底治愈。基因治療作為腫瘤治療的一種新手段，在該領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用前景。近年來， 腫瘤治療中最引人注目的腺病毒載體是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體(Conditionally ReplicatingOncolytic Adenoviral Vector, CRAd)。這類載體感染細(xì)胞之后，可以選擇性地在腫瘤組織中迅速復(fù)制，大量擴(kuò)增并最終將腫瘤細(xì)胞殺死，其子代細(xì)胞又會(huì)感染周圍的腫瘤細(xì)胞并且繼續(xù)復(fù)制，最終殺死周邊的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)周圍的正常細(xì)胞產(chǎn)生很少影響，故具有明顯的抗腫瘤活性。CRAd載體大致可分為兩種類型，一類是刪除一些特定基因，這些特定基因是病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制所必需、而在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制非必需的。它包括ElB-55kD缺失和 ElA-Mbp缺失。另一類是利用腫瘤特異性啟動(dòng)子控制病毒復(fù)制所必需的基因。但由于腫瘤的惡性程度與腺病毒受體呈負(fù)相關(guān)的特點(diǎn)，導(dǎo)致其治療效果并不十分理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題在于克服上述條件復(fù)制型腺病毒載體的缺點(diǎn)，提供一種對(duì)腫瘤組織感染效率高、能增加載體外源基因表達(dá)數(shù)目的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題在于提供一種方法簡單、操作簡便的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明所要解決的還有一個(gè)技術(shù)問題在于為纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體提供一種新的用途。解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是在人腺病毒5型基因組922bp_947bp之間有Mbp堿基的缺失；在人腺病毒5型基因組^183bp 29906bp之間插入一個(gè)表達(dá)第一外源基因的表達(dá)元件；在人腺病毒載體5型基因組中31042bp處即纖維蛋白Tail處，插入一個(gè)纖維蛋白嵌合體；在人腺病毒載體5型基因組中32021bp與32022bp之間插入雙表達(dá)第二外源基因與eGFP的表達(dá)元件；上述的纖維蛋白嵌合體為5/3F、5/6F、5/30F、5/llF、5/35F 序列中的任意一個(gè)。本發(fā)明的第一外源基因是 Arresten、IL-24、Endostatin、Canstatin、I\imostatin、 IFNa、IL_12中的任意一種。本發(fā)明的第二外源基因是 TRAIL、IL-24、Endostatin、Canstatin、Tumostatin、 IFNa、工L-12中的任意一種。
上述的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法由下述步驟組成1、構(gòu)建pAd5 ElA Mbp缺失的穿梭載體通過設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，以Ad5基因組質(zhì)粒為PCR模板，經(jīng)過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得含有Ad5ElA分子中Mbp堿基缺失的基因片段，P1-P4為兩對(duì)引物的序列Pl:ATTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATT ；P2 :TCCTCGTCGTCACTGGGTGGAATCCAAAATAAGGTATATTATTGATGATG ；P3 :CCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTT ；P4 TACTAGTCCGCTCTCCACAGATGCATGGCCAG 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是94°C、2分鐘，94°C、50秒，55°C、60秒，72°C、2分鐘， 30個(gè)循環(huán)；重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后回收片段；將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與PGEMT-T eaSy載體連接；連接條件是2 μ 1酶切純化片段，5 μ 12 X T4 連接酶緩沖液，0. 5μ1 pGEMT-T easy載體，0.5 μ I1M連接酶，2 μ 1三蒸水，25°C連接1小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中；挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測(cè)序鑒定陽性克隆；將所獲得陽性克隆命名為pGEMT/ Ad5-D24F ；將Ad5_D24F片段從pGEMT/Ad5_D24F上經(jīng)PacI和SpeI雙酶切下來，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳純化后與用I^cI和SpeI雙酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體進(jìn)行連接；連接條件是2μ 1酶切純化片段，5 μ 1 2ΧΤ4連接酶緩沖液，0. 5μ 1酶切載體， 0. 5μ 1Τ4連接酶，2 μ 1三蒸水；連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pHBD2hhuttle，此載體為獲得的pAd5ElA 24bp缺失的穿梭載體。2、構(gòu)建pHBDM腺病毒載體骨架將kal線性化的pHBD2hhuttle穿梭載體與ClaI線性化腺病毒骨架載體 pTG3602/SwaI按摩爾比3 1，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BJ5183，將菌液涂布在含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，16 M小時(shí)后，挑取菌落，接種到100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA ；經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為Ad5ElA分子中M個(gè)堿基缺失的腺病毒載體骨架，命名為PHBD24。3、構(gòu)建pHBDE3-第一外源基因的穿梭載體通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增位于Ad5E3區(qū)12. 5k 3，端上游2. Okb的片段，基因片段分別含有I^acI與SalI-SwaI位點(diǎn)，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，由此得到的載體稱為pshuttle Ad5E3-5，；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增位于Ad5E3區(qū) E314. 7k 5’端下游2. Okb的片段，基因片段分別含有SwaI-NotI與SpeI位點(diǎn)；將此片段克隆到pshuttle Ad5E3-5’載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，由此得到的載體稱為pshuttle Ad5E3，命名為PHBDE3 ；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增第一外源基因，經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α，小量提取DNA，經(jīng)酶切鑒定，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/第一外源基因；在PHBDE3載體的上下游兩個(gè)基因片段之間通過MlI與NotI插入第一外源基因表達(dá)元件；得到的載體即為表達(dá)第一外源基因的腺病毒E3穿梭載體，命名為pHBDE3-第一夕卜源基因shuttle。4、構(gòu)建pHBDE3-第一外源基因/SwaI條件復(fù)制型腺病毒載體骨架
用I^cI線性化的表達(dá)第一外源基因shuttle的穿梭載體與SwaI線性化的pHBD24 腺病毒載體骨架按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化E. coli BJ5183，通過酶切及測(cè)序獲得陽性克隆，所得到的載體稱為PHBD24-第一外源基因/Swal。5、構(gòu)建pshuttle Ad5_E4-纖維蛋白嵌合體穿梭載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，在氨芐抗性基因的開放讀碼框的兩端通過基因突變的方式產(chǎn)生兩個(gè)單一的酶切位點(diǎn))(bal及Sful，將卡那抗性基因克隆到^CbaI和SfuI的位點(diǎn)中， 所獲得的卡那抗性載體與EcoRI-Hindlll linker連接，獲得的載體命名為pUCKanEHL ； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增位于Ad5E4區(qū)3’端上游2.01Λ的片段，基因片段兩端分別含有 I^cI與SwaI位點(diǎn)，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，得到的載體稱為 pshuttleAd5E4-3'；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增Ad5纖維蛋白3，端上游2. Okb的片段，基因片段兩端分別含有SwaI與SpeI位點(diǎn)；將此片段克隆到pshuttle Ad5E4_3’載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，獲得的新載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber ；合成Ad5的Tail以及纖維蛋白嵌合體的Shaft和Knob序列，在Ad5的Tai 1序列上含有NdeI位點(diǎn)，在纖維蛋白嵌合體的Knob3'端引入SpeI位點(diǎn)，通過NdeI和SpeI雙酶切，將此序列克隆到pshuttle Ad5-E4-fiber載體的相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，所獲得的新載體稱為pshuttle Ad5-E4_纖維蛋白嵌合體。6、構(gòu)建表達(dá)eGFP及第二外源基因的穿梭載體pshuttle Ad5_CMVeGFP/第二外源基因-E4-纖維蛋白嵌合體序列通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增miniCMV-SV40表達(dá)元件，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與pGEMTeasy載體連接，通過酶切及測(cè)序鑒定陽性克隆，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/ miniCMV-SV40,將 miniCMV_SV40 片段從 pGEMT/miniCMV_SV40 上經(jīng) ClaI 和 NotI 雙酶切下來，與經(jīng)同樣酶切的雙向啟動(dòng)子穿梭載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40 ；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增第二外源基因，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)電泳純化后與PGEMT easy載體相連接， 經(jīng)酶切鑒定，獲得陽性克隆命名為pGEMT/第二外源基因，將第二外源基因片段從pGEMT/ 第二外源基因上經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切下來，用相同雙酶切處理的pshuttle-Bio-PGK-eG FP-miniCMV-SV40進(jìn)行連接；連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，所獲得的載體為表達(dá)eGFP及第二外源基因的雙向啟動(dòng)子穿梭載體，命名為 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；eGFP及第二外源基因的雙向啟動(dòng)子穿梭載體，命名為 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；將 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因經(jīng) BamHI 及 SfuI雙酶切末端補(bǔ)平后與經(jīng)SwaI酶切的腺病毒pshuttle Ad5_E4-纖維蛋白嵌合體穿梭載體進(jìn)行連接，獲得的陽性克隆為表達(dá)eGFP及第二外源基因的腺病毒pshuttle Ad5-E4_纖維蛋白嵌合體穿梭載體，命名為pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-纖維蛋白嵌合體。7、制備纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒HBD24-纖維蛋白嵌合體.第一外源基因/第二外源基因用BioI線性化的pshuttle Ad5_CMVeGFP/第二外源基因_E4_纖維蛋白嵌合體的穿梭載體與SwaI線性化的pHBD24-第一外源基因/SwaI腺病毒載體骨架按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化E. coliBJ5183，通過酶切及測(cè)序獲得陽性克隆，所得到的載體命名為pHBD24_纖維蛋白嵌合體.第一外源基因/第二外源基因；采用磷酸鈣法將I^cI線性化的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體PHBD24-纖維蛋白嵌合體.第一外源基因/第二外源基因的轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞系，經(jīng)過7 10天后，離心收獲病毒原液，經(jīng)2 3輪的病毒擴(kuò)增， 通過兩次氯化銫密度梯度超速離心純化，獲得純化的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒HBD24-纖維蛋白嵌合體.第一外源基因/第二外源基因，-80°C冰箱內(nèi)保存。纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療惡性腦膠質(zhì)瘤藥物中的用途。纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療肝癌藥物中的用途。纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療胃癌藥物中的用途。纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療肺癌藥物中的用途。纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療結(jié)腸癌藥物中的用途。纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療乳腺癌藥物中的用途。纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療黑色素瘤藥物中的用途。本發(fā)明在Ad5DM條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體的基礎(chǔ)上，經(jīng)過兩方面的改造以提高增加載體外源基因的表達(dá)數(shù)目個(gè))，對(duì)病毒載體進(jìn)行修飾以提高其感染效率。采用本發(fā)明構(gòu)建方法構(gòu)建的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL，經(jīng)藥效試驗(yàn)表明，纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體 HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用。


圖1是纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病: Arresten/TRAIL的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病: Arresten/TRAIL對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞的生長抑制曲線。圖3是纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病: Arresten/TRAIL對(duì)肝癌細(xì)胞系H印G2細(xì)胞的生長抑制曲線。圖4是纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病: Arresten/TRAIL對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞的生長抑制曲線。圖5是纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病: Arresten/TRAIL對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的生長抑制曲線。圖6是纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病:
載體 HBD24-5/11F.
載體 HBD24-5/11F.
載體 HBD24-5/11F.
載體 HBD24-5/11F.
載體 HBD24-5/11F.
載體 HBD24-5/11F.
8Arresten/TRAIL對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco_2細(xì)胞的生長抑制曲線。圖7是纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞的生長抑制曲線。圖8是纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系B16F10_G5_luc細(xì)胞的生長抑制曲線。圖9是纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL在腦膠質(zhì)瘤模型動(dòng)物中的抑制曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1本實(shí)施例的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL 如下1、在人腺病毒載體5型基因組中第92^p-947bp之間有Mbp堿基的缺失。所缺失的 24bp 堿基序列為CTTACCTGCCACCAGGCTGGCTTT02、在人腺病毒載體5型基因組中28183bp 29906bp之間插入一個(gè)Arresten表達(dá)元件，Arresten表達(dá)元件的序列為gtcgacacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcatcgatatgtctgttgatcacggcttccttgtgaccaggcatagtcaaacaatagatgacccacagtgtccttctgggaccaaaattctttaccacgggtactctttgctctacgtgcaaggcaatgaacgggcccatggccaggacttgggcacggccggcagctgcctgcgcaagttcagcacaatgcccttcctgttctgcaatattaacaacgtgtgcaactttgcatcacgaaatgactactcgtactggctgtccacccctgagcccatgcccatgtcaatggcacccatcacgggggaaaacataagaccatttattagtaggtgtgctgtgtgtgaggcgcctgccatggtgatggccgtgcacagccagaccattcagatcccaccgtgccccagcgggtggtcctcgctgtggatcggctactcttttgtgatgcacaccagcgctggtgcagaaggctctggccaagccctggcgtcccccggctcctgcctggaggagtttagaagtgcgccattcatcgagtgtcacggccgtgggacctgcaattactacgcaaacgcttacagcttttggctcgccaccatagagaggagcgagatgttcaagaagcctacgccgtccaccttgaaggcaggggagctgcgcacgcacgtcagccgctgccaagtctgtatgagaagaacataactcgagcacagcggggacacagcggggagatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctgattatgatccggctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacaca
tgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgaggcggccgc。3、在人腺病毒載體5型基因組中31042bp處即纖維蛋白Tail處，插入一個(gè)纖維蛋白嵌合體5/11F，纖維蛋白嵌合體5/11F的序列為atgaagcgcgcaagaccgtctgaagataccttcaaccccgtgtatccatatgacacggaaaccggtcctccaactgtgccttttcttactcctccctttgtatcccccaatgggtttcaagagagtccccctggtcttactttaaaatgtttaaccccgctaacaaccacaggcgggtctctacagctaaaagtgggagggggacttacagtagatgacactgatgggaccttacaagaaaacataggtaccaccacaccacttgttaagactgggcactctataggtttatccctaggagccggattgggaacagatgaaaataaactttgtaccaaattgggaaaaggacttacattcaattcaaacaacatttgcattgatgacaatattaacaccctgtggacaggaattaaccccaccgaagccaactgtcaaatgatggactccagtgaatctaatgattgcaaattaattctaacactagttaaaactggagccctagtcactgcatttgtttatgttataggagtatctaacaattttaatatgctaactacatacagaaatataaattttactgcggagctgttttttgattctgcgggtaatttactaactagcctgtcatccctaaaaactccacttaatcataaatcaggacaaaacatggctactggtgccattactaatgctaaaagtttcatgcccagcacaactgcttatcctttcaataataattctagagaaaaagaaaactacatttacggaacctgtcactacacagctagtgatcacactgcttttcccattgacatatctgtcatgcttaaccaaagagcaataagagctgatacatcatattgtattcgtataacttggtcctggaacacaggagatgccccagaggggcaaacctctgctacaaccctagttacctccccatttaccttttactacatcagag已已gacgactga04、在人腺病毒載體5型基因組中32021bp 32022bp之間插入雙表達(dá)TRAIL與 eGFP的表達(dá)元件，雙表達(dá)TRAIL與eGFP的表達(dá)元件序列為agatctccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctcccccttgctgtcctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtctagattacttgtacagctcgtccatgccgagagtgatcccggcggcggtcacgaactccagcaggaccatgtgatcgcgcttctcgttggggtctttgctcagggcggactgggtgctcaggtagtggttgtcgggcagcagcacggggccgtcgccgatgggggtgttctgctggtagtggtcggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcagatgaacttcagggtcagcttgccgtaggtggcatcgccctcgccctcgccggacacgctgaacttgtggccgtttacgtcgccgtccagctcgaccaggatgggcaccaccccggtgaacagctcctcgcccttgctcaccatctcgagatacagctccaccgcacatgccaccctccggatatattcgtctcgagcaaatcactcgagtatgtcgaggtggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgttggcagtctagcggctagcacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatg
acggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcatcgatatggctatgatggaggtccaggggggacccagcctgggacagacctgcgtgctgatcgtgatcttcacagtgctcctgcagtctctctgtgtggctgtaacttacgtgtactttaccaacgagctgaagcagatgcaggacaagtactccaaaagtggcattgcttgtttcttaaaagaagatgacagttattgggaccccaatgacgaagagagtatgaacagcccctgctggcaagtcaagtggcaactccgtcagctcgttagaaagatgattttgagaacctctgaggaaaccatttctacagttcaagaaaagcaacaaaatatttctcccctagtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaaactagtggatccggctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatcacaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttgaattcgctgtctgcgagggccggctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgacttctgcggccgc0上述的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒HBD24-5/11F. Arresten/ TRAIL載體的構(gòu)建方法步驟如下1、構(gòu)建Ad5ElA分子中Mbp堿基缺失的穿梭載體通過設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，以Ad5基因組質(zhì)粒為PCR模板，經(jīng)過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得含有Ad5ElA分子中Mbp堿基缺失的基因片段。P1-P4為兩對(duì)引物的序列Pl :ATTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATT ；P2 :TCCTCGTCGTCACTGGGTGGAATCCAAAATAAGGTATATTATTGATGATG ；P3 :CCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTT ；P4 :TACTAGTCCGCTCTCCACAGATGCATGGCCAG。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是94°C、2分鐘，94°C、50秒，55°C、60秒，72°C、2分鐘， 30個(gè)循環(huán)。重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后回收片段。將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與PGEMT-T eaSy載體連接。連接條件是2 μ 1酶切純化片段，5 μ 12 X iM 連接酶緩沖液，0. 5μ1 pGEMT-T easy載體，0.5μ1 fM連接酶，2 μ 1三蒸水，25°C連接1小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測(cè)序鑒定陽性克隆。將所獲得陽性克隆命名為pGEMT/ Ad5-D24F0將Ad5-DMF片段從pGEMT/Ad5_DMF上經(jīng)PacI和SpeI雙酶切下來，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳純化后與用I^cI和SpeI雙酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體進(jìn)行連接。連接條件是2 μ 1酶切純化片段，5 μ 1 2\1~4連接酶緩沖液，0.54 1酶切載體，0.5口1 Τ4連接酶，2 μ 1三蒸水。連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為PHBD24 shuttle，此載體為獲得的pAd5 ElA Mbp缺失的穿梭載體。2、構(gòu)建pHBDM腺病毒載體骨架將kal線性化的pHBD2hhuttle穿梭載體與ClaI線性化腺病毒骨架載體 pTG3602/SwaI按摩爾比3 1，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BJ5183，將菌液涂布在含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，16 M小時(shí)后，挑取菌落，接種到100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為Ad5ElA分子中M個(gè)堿基缺失的腺病毒載體骨架，命名為PHBD24。3、構(gòu)建 pHBDE3_Arresten 的穿梭載體通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增位于Ad5E3區(qū)12. 5k 3，端上游約2. Okb的片段， 基因片段分別含有he I與Ml I-SwaI位點(diǎn)，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，由此得到的載體稱為pshuttle Ad5E3-5’。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增位于Ad5E3區(qū)E314. 7k 5，端下游2. Okb的片段，基因片段分別含有SwaI-NotI與SpeI位點(diǎn)。將此片段克隆到pshuttle Ad5E3-5’載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，由此得到的載體稱為 pshuttle Ad5E3，命名為pHBDE3。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增Arresten，經(jīng)電泳純化后與 pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α，小量提取DNA，經(jīng)酶切鑒定，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/Arresten。在pHBDE3載體的上下游兩個(gè)基因片段之間通過Mil與NotI插入Arresten表達(dá)元件。這樣所得到的載體即為表達(dá)第一外源基因的腺病毒E3穿梭載體， 命名為 pHBDE3-Arresten shuttle。4、構(gòu)建pHBDE3_Arresten/SwaI條件復(fù)制型腺病毒載體骨架用I^cI線性化的表達(dá)Arresten的穿梭載體與SwaI線性化的pHBDM腺病毒載體骨架按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化E. coli BJ5183，然后通過酶切及測(cè)序獲得陽性克隆，所得到的載體稱為 pHBDM-Arresten/Swal。5、構(gòu)建 pshuttle Ad5-E4_5/11F 穿梭載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，在氨芐抗性基因的開放讀碼框的兩端通過基因突變的方式產(chǎn)生兩個(gè)單一的酶切位點(diǎn))(bal及Sful，將卡那抗性基因克隆到^CbaI和SfuI的位點(diǎn)中， 所獲得的卡那抗性載體與EcoRI-Hindlll linker連接，獲得的載體命名為pUCKanEHL ； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增位于Ad5E4區(qū)3'端上游2.01Λ的片段，基因片段兩端分別含有 I^cI與SwaI位點(diǎn)，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，得到的載體稱為 pshuttleAd5E4-3'；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增Ad5纖維蛋白3'端上游2. Okb的片段，基因片段兩端分別含有SwaI與SpeI位點(diǎn)；將此片段克隆到pshuttle Ad5E4_3 ‘載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，獲得的新載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber。合成Ad5的Tail以及Adll纖維蛋白的Shaft和Knob序列，在Ad5的Tail序列上含有NdeI位點(diǎn)，在Adll纖維蛋白的Knob3'端引入SpeI位點(diǎn)，通過NdeI和SpeI雙酶切，將此序列克隆到pshuttle Ad5-E4-fiber載體的相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，所獲得的新載體稱為pshuttle Ad5-E4_5/11F。6、構(gòu)建表達(dá) eGFP 及 TRAIL 的穿梭載體 pshuttle Ad5-CMVeGFP/TRAIL-E4-5/lIF通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增miniCMV-SV40表達(dá)元件，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與pGEMT-Teasy載體連接，通過酶切及測(cè)序鑒定陽性克隆，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/ miniCMV-SV40,將 miniCMV_SV40 片段從 pGEMT/miniCMV_SV40 上經(jīng) ClaI 和 NotI 雙酶切下來，與經(jīng)同樣酶切的雙向啟動(dòng)子穿梭載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為ρshu111 e-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40 ；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增TRAIL基因，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接， 經(jīng)酶切鑒定，獲得陽性克隆命名為pGEMT/TRAIL，將TRAIL基因片段從pGEMT/TRAIL上經(jīng) XhoI和XbaI雙酶切下來，用相同雙酶切處理的pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV_SV40進(jìn)行連接；連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，所獲得的載體為表達(dá)eGFP及TRAIL的雙向啟動(dòng)子穿梭載體，命名為pshuttle-Bio-eGFP-TRAIL ； eGFP及TRAIL的雙向啟動(dòng)子穿梭載體，命名為pshuttle-Bio-eGFP-TRAIL ；將 pshuttle-Bio-eGFP-TRAIL經(jīng)BamHI及SfuI雙酶切末端補(bǔ)平后與經(jīng)SwaI酶切的腺病毒 pshuttle Ad5-E4-5/llF穿梭載體進(jìn)行連接，獲得的陽性克隆為表達(dá)eGFP及TRAIL的腺病毒 pshuttle Ad5-E4-5/llF 穿梭載體，命名為 pshuttleAd5-CMVeGFP/TRAIL-E4_5/llF。7、制備纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒HBD24-5/llF.Arresten/ TRAIL用XhoI 線性化的 pshuttle Ad5-CMVeGFP/TRAIL-E4-5/lIF 的穿梭載體與 SwaI 線性化的pHBD24-Arresten/SwaI腺病毒載體骨架按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化E. coli BJ5183, 通過酶切及測(cè)序獲得陽性克隆，所得到的載體命名為pHBD24-5/l IF. Arresten/TRAIL ； 采用磷酸鈣法將I^acI線性化的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體 PHBD24-5/11F. Arresten/TRAIL轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞系，經(jīng)過7 10天后，離心收獲病毒原液，經(jīng)2 3輪的病毒擴(kuò)增，通過兩次氯化銫密度梯度超速離心純化，獲得純化的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL, _80°C冰箱內(nèi)保存。實(shí)施例2本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Endostatin/TRAIL 口下實(shí)施例1中的第一外源基因Arresten用Endostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1 相同，構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/1 IF. Endostatin/ TRAIL。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. IL-24/TRAIL 如下實(shí)施例1中的第一外源基因Arresten用IL44替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同， 構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. IL-24/TRAIL。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F.Tumostatin/TRAIL 如下實(shí)施例1中的第一外源基因Arresten用Tumostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1 相同，構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/1 IF. Tumostatin/ TRAIL。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例5本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Canstatin/TRAIL 如下實(shí)施例1中的第一外源基因Arresten用Canstatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1 相同，構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Canstatin/ TRAIL。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例6本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. IFNa /TRAIL 如下實(shí)施例1中的第一外源基因Arresten用IFNa替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同， 構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. IFNa /TRAIL。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例7本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. IL-12/TRAIL 如下實(shí)施例1中的第一外源基因Arresten用IL-12替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同， 構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. IL-12/TRAIL。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例8本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/Endostatin 如下實(shí)施例1中的第二外源基因TRAIL用Endostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1 相同，構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/ Endostatin。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例9本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/Tumostatin 如下實(shí)施例1中的第二外源基因TRAIL用Tumostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1 相同，構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/ Tumostatin0其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例10CN 102229962 A
說明書
11/16 頁本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/Canstatin 如下實(shí)施例1中的第二外源基因TRAIL用Canstatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1 相同，構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/ Canstatin0其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例11本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/IL-24 如下實(shí)施例1中的第二外源基因TRAIL用IL-M替換。元件的其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1 相同，構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/ IL-24。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例12本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/IL-12 如下實(shí)施例1中的第二外源基因TRAIL用IL-12替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同，構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/IL-12。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例13本實(shí)施例纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/IFNa 如下實(shí)施例1中的第二外源基因TRAIL用IFNa替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同，構(gòu)成纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/IFNa。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例14以上的實(shí)施例1 13，在腺病毒5型基因組第31042bp處即纖維蛋白Tail處，插入的5/11F序列用5/3F序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例15以上的實(shí)施例1 13，在腺病毒5型基因組第31042bp處即纖維蛋白Tail處，插入的5/11F序列用5/6F序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例16以上的實(shí)施例1 13，在腺病毒5型基因組第31042bp處即纖維蛋白Tail處，插入的5/11F序列用5/30F序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例17以上的實(shí)施例1 13，在腺病毒5型基因組第31042bp處即纖維蛋白Tail處，插入的5/11F序列用5/35F序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例18有效成分纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療惡性腦膠質(zhì)瘤、肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤藥物用常規(guī)藥用制劑的形式來使用。所述的藥用常規(guī)制劑含作為活性成分的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體，該活性成分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體如適宜于靜脈注射給藥的有機(jī)或無機(jī)固體或液體賦形劑混合，在制劑中，活性成分的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體含量為 95%。為了驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用本發(fā)明實(shí)施例1的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL (以下簡稱HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL)進(jìn)行了藥效試驗(yàn)，各種試驗(yàn)情況如下UHBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長抑制作用采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法檢測(cè) HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87增殖的影響，具體操作如下取對(duì)數(shù)生長期的惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 的胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1. 5X 103。將10M0I的HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL病毒載體及對(duì)照病毒感染惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液(PBQ處理作為對(duì)照組。分別在1 4天檢測(cè)以上病毒載體對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87生長的抑制作用。每對(duì)小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜 (DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫反應(yīng)10分鐘。用酶標(biāo)儀在570nm波長處測(cè)吸光值，所測(cè)結(jié)果用統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案軟件(SPSS) 13.0的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可見，HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL 對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87增殖具有明顯的抑制作用(*P < 0. 01)。2、HBD24_5/11F. Arresten/TRAIL 對(duì)肝癌細(xì)胞生長抑制作用采用MTT比色法檢測(cè)HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)肝癌細(xì)胞系H印G2增殖的影響，具體操作如下取對(duì)數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞系H印G2，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 的胰酶消化后接種于96 孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1.5X103，將10M0I的HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL病毒載體及對(duì)照病毒感染肝癌細(xì)胞系IfepG2，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理作為對(duì)照組。分別在1 4天檢測(cè)以上病毒載體對(duì)肝癌細(xì)胞系!fepG2生長的抑制作用。每M小時(shí)后加入 5g/L的MTT20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜150 μ L，置于水平搖床上，室溫反應(yīng)10分鐘。用酶標(biāo)儀在570nm波長處測(cè)吸光值，所測(cè)結(jié)果用SPSS 13. O軟件的One WayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖 3可見，HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)肝癌細(xì)胞系H印G2增殖具有明顯的抑制作用(*P < 0. 01)。3、HBD24_5/11F. Arresten/TRAIL 對(duì)胃癌細(xì)胞生長抑制作用采用MTT比色法檢測(cè)HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823增殖的影響，具體操作如下
取對(duì)數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞系BGC-823，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1 %的胰酶消化后接種于 96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1.5X103，將10M0I的HBDM-5/11F. Arresten/TRAIL病毒載體及對(duì)照病毒感染胃癌細(xì)胞系BGC-823，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理作為對(duì)照組。分別在1 4天檢測(cè)以上病毒載體對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823生長的抑制作用。每M小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜150 μ L，置于水平搖床上，室溫反應(yīng)10分鐘。用酶標(biāo)儀在570nm波長處測(cè)吸光值，所測(cè)結(jié)果用SPSS 13. 0軟件的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。由圖4 可見，HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823增殖具有明顯的抑制作用(*P
<0. 05)。4、HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL 對(duì)肺癌細(xì)胞生長抑制作用采用MTT比色法檢測(cè)HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖的影響，具體操作如下取對(duì)數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1 %的胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1. 5X 103。將5M0I的HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL病毒載體及對(duì)照病毒感染肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理作為對(duì)照組。分別在1 4天檢測(cè)以上病毒載體對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549生長的抑制作用。每M小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用 10分鐘。用酶標(biāo)儀570nm波長處測(cè)吸光值，所得結(jié)果用SPSS 13. 0軟件的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖5可見，HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖具有明顯的抑制作用(*P < 0. 01)。5、HBD24_5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長抑制作用采用MTT比色法檢測(cè)HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco_2增殖的影響，具體操作如下取對(duì)數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 的胰酶消化后接種于 96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1. 5X ΙΟ3。5M0I的HBDM-5/11F. Arresten/TRAIL病毒載體及對(duì)照病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理作為對(duì)照組。分別在1 4天檢測(cè)以上病毒載體對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2生長的抑制作用。每M小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。用酶標(biāo)儀570nm波長處測(cè)吸光值，所得結(jié)果用SPSS 13. O軟件的 One WayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。由圖6可見，HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2增殖具有明顯的抑制作用(*P
<0. 05)。6、HBD24_5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長抑制作用采用MTT 比色法檢測(cè) HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL 對(duì)乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231 增殖的影響，具體操作如下取對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 的胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1.5X03。將10M0I的HBDM-5/1 IF. Arresten/TRAIL病毒載體及對(duì)照病毒感染乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理作為對(duì)照組。分別在1 4天檢測(cè)以上病毒載體對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231生長的抑制作用。培養(yǎng)48小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜 150 μ L，置于水平搖床上，室溫反應(yīng)10分鐘。用酶標(biāo)儀570nm波長處測(cè)吸光值，所得結(jié)果用 SPSS 13.0軟件的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。由圖7可見，HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231增殖具有明顯的抑制作用(*P < 0. 01)。7、HBD24_5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的生長抑制作用采用MTT比色法檢測(cè)HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系 B16F10-G5-luc增殖的影響，具體操作如下取對(duì)數(shù)生長期的黑色素瘤細(xì)胞系B16F10-G5-1UC，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 的胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1. 5X 103。將10M0I的HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL 病毒載體及對(duì)照病毒感染黑色素瘤細(xì)胞系B16F10-G5-1UC，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理作為對(duì)照組。分別在1 4天檢測(cè)以上病毒載體對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系B16F10-G5-1UC 生長的抑制作用。培養(yǎng)48小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，去掉培養(yǎng)基， 加入二甲基亞砜150 μ L，置于水平搖床上，室溫反應(yīng)10分鐘。用酶標(biāo)儀570nm波長處測(cè)吸光值，所得結(jié)果用SPSS 13.0軟件的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。由圖8可見，HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系 B16F10-G5-luc增殖具有明顯的抑制作用(*P < 0. 01)。8、采用HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL針對(duì)建立的腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)采用U87細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，離心后，無血清、無雙抗、無谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液懸浮，制備7. 5 X IOVmL的細(xì)胞懸液。選用6周齡BALB/C雌性裸鼠，裸鼠用乙醚吸入麻醉，每只右后肢上部皮下注射200 μ 1的7. 5 X IOVmL的細(xì)胞懸液，U87MG細(xì)胞注射量為2 X IO6個(gè)細(xì)胞，在細(xì)胞接種3天后均可見腫塊近似大小的腫瘤生長。接種一周后， 腫瘤平均體積達(dá)到70 IOOmm3時(shí)，建立腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，注射HBD24-5/11F. Arresten/ TRAIL進(jìn)行觀測(cè)對(duì)腦膠質(zhì)瘤生長抑制效果。裸鼠模型隨機(jī)分為磷酸鹽緩沖液空白組、Ad5-eGFP對(duì)照組、HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL實(shí)驗(yàn)組，每組7只，空白組每只裸鼠注射50 μ 1磷酸鹽緩沖液，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每只裸鼠均注射1 X IO10PFU的腺病毒試驗(yàn)品，每兩天重復(fù)注射1次，共4次，每次劑量均為lXKTPFU。開始治療后每兩天測(cè)量腫瘤體積1次，統(tǒng)計(jì)體積變化趨勢(shì)并繪制腫瘤生長曲線，測(cè)量4周腫瘤體積。并用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0中的Oneway-ANOVA進(jìn)行顯著性差異分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9。由圖9可見，實(shí)驗(yàn)組與空白組、對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HBD24-5/11F. Arresten/TRAIL 可以明顯抑制實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭心X膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長速度，具有明顯的抑制腦膠質(zhì)瘤生長效果 (*P < 0. 05)。、20
權(quán)利要求
1.一種纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體，其特征在于在人腺病毒5型基因組922bp-947bp之間有Mbp堿基的缺失；在人腺病毒5型基因組^183bp 29906bp之間插入一個(gè)表達(dá)第一外源基因的表達(dá)元件；在人腺病毒載體5型基因組中 31042bp處即纖維蛋白Tail處，插入一個(gè)纖維蛋白嵌合體；在人腺病毒載體5型基因組中 32021bp與32022bp之間插入雙表達(dá)第二外源基因與eGFP的表達(dá)元件；上述的纖維蛋白嵌合體為5/3F、5/6F、5/30F、5/llF、5/35F序列中的任意一個(gè)。
2.按照權(quán)利要求1所述的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體，其特征在于所說的第一夕卜源基因是 Arresten、IL—24、Endostatin、Canstatin、Tumostatin、 IFNa、IL_12中的任意一種。
3.按照權(quán)利要求1所述的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體，其特征在于所說的第二外源基因是 TRAIL、IL-24、Endostatin、Canstatin、Tumostatin、IFNa、 IL-12中的任意一種。
4.一種權(quán)利要求1纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于它是由下述步驟組成(1)構(gòu)建pAd5ElAMbp缺失的穿梭載體通過設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，以Ad5基因組質(zhì)粒為PCR模板，經(jīng)過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得含有 Ad5ElA分子中Mbp堿基缺失的基因片段，P1-P4為兩對(duì)引物的序列Pl :ATTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATT ；P2 :TCCTCGTCGTCACTGGGTGGAATCCAAAATAAGGTATATTATTGATGATG ；P3 :CCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTT ；P4 :TACTAGTCCGCTCTCCACAGATGCATGGCCAG ；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是94°C、2分鐘，94°C、50秒，55 °C、60秒，72 °C、2分鐘，30個(gè)循環(huán)；重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后回收片段；將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與PGEMT-T eaSy載體連接；連接條件是2μ 1酶切純化片段，5 μ 12 X Τ4連接酶緩沖液，0. 5 μ IpGEMT-T easy載體，0. 5 μ 1 Τ4連接酶，2 μ 1三蒸水，25°C連接1小時(shí)， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中；挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測(cè)序鑒定陽性克?。粚⑺@得陽性克隆命名為pGEMT/ Ad5-D24F ；將Ad5_D24F片段從pGEMT/Ad5_D24F上經(jīng)PacI和SpeI雙酶切下來，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳純化后與用I^cI和SpeI雙酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體進(jìn)行連接；連接條件是2μ 1酶切純化片段，5 μ 1 2ΧΤ4連接酶緩沖液，0. 5μ 1酶切載體， 0. 5μ 1Τ4連接酶，2 μ 1三蒸水；連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pHBD2hhuttle，此載體為獲得的pAd5ElAMbp缺失的穿梭載體；(2)構(gòu)建pHBDM腺病毒載體骨架將kal線性化的pHBD2hhuttle穿梭載體與ClaI線性化腺病毒骨架載體pTG3602/ SwaI按摩爾比3 1，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BJ5183，將菌液涂布在含有100yg/ml的氨芐青霉素的LB平板中，16 M小時(shí)后，挑取菌落，接種到100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA ；經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為Ad5ElA分子中M個(gè)堿基缺失的腺病毒載體骨架，命名為PHBD24 ；(3)構(gòu)建PHBDE3-第一外源基因的穿梭載體通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增位于Ad5E3區(qū)12. 5k 3’端上游2. Okb的片段，基因片段分別含有I^acI與SalI-SwaI位點(diǎn)，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中， 由此得到的載體稱為pshuttle Ad5E3-5’ ；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增位于Ad5E3區(qū) E314. 7k 5，端下游2. Okb的片段，基因片段分別含有SwaI-NotI與SpeI位點(diǎn)；將此片段克隆到pshuttle Ad5E3-5’載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，由此得到的載體稱為pshuttle Ad5E3，命名為pHBDE3 ；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增第一外源基因，經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α，小量提取DNA，經(jīng)酶切鑒定，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/第一外源基因；在PHBDE3載體的上下游兩個(gè)基因片段之間通過MlI與NotI插入第一外源基因表達(dá)元件；得到的載體即為表達(dá)第一外源基因的腺病毒E3穿梭載體，命名為pHBDE3-第一外源基因shuttle ；(4)構(gòu)建pHBDE3-第一外源基因的穿梭載體構(gòu)建pHBDE3-第一外源基因/SwaI條件復(fù)制型腺病毒載體骨架用I^cI線性化的表達(dá)第一外源基因shuttle的穿梭載體與SwaI線性化的pHBDM腺病毒載體骨架按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化E. coli BJ5183，通過酶切及測(cè)序獲得陽性克隆，所得到的載體稱為PHBD24-第一外源基因/SwaI ；(5)構(gòu)建pshuttleAd5-E4-纖維蛋白嵌合體穿梭載體以PUC19載體為基礎(chǔ)，在氨芐抗性基因的開放讀碼框的兩端通過基因突變的方式產(chǎn)生兩個(gè)單一的酶切位點(diǎn))(bal及SfuI，將卡那抗性基因克隆到^CbaI和SfuI的位點(diǎn)中， 所獲得的卡那抗性載體與EcoRI-Hindlll linker連接，獲得的載體命名為pUCKanEHL ； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增位于Ad5E4區(qū)3’端上游2.01Λ的片段，基因片段兩端分別含有 I^cI與SwaI位點(diǎn)，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，得到的載體稱為 pshuttleAd5E4-3'；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增Ad5纖維蛋白3，端上游2. Okb的片段，基因片段兩端分別含有SwaI與SpeI位點(diǎn)；將此片段克隆到pshuttle Ad5E4_3’載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，獲得的新載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber ；合成Ad5的Tail以及纖維蛋白嵌合體的Shaft和Knob序列，在Ad5的Tai 1序列上含有NdeI位點(diǎn)，在纖維蛋白嵌合體的Knob3'端引入SpeI位點(diǎn)，通過NdeI和SpeI雙酶切，將此序列克隆到pshuttle Ad5-E4-fiber載體的相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，所獲得的新載體稱為pshuttle Ad5-E4_纖維蛋白嵌合體；(6)構(gòu)建表達(dá)eGFP及第二外源基因的穿梭載體pshuttleAd5_CMVeGFP/第二外源基因-E4-纖維蛋白嵌合體序列通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增miniCMV-SV40表達(dá)元件，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與pGEMTeasy載體連接，通過酶切及測(cè)序鑒定陽性克隆，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/ miniCMV-SV40,將 miniCMV_SV40 片段從 pGEMT/miniCMV_SV40 上經(jīng) ClaI 和 NotI 雙酶切下來，與經(jīng)同樣酶切的雙向啟動(dòng)子穿梭載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40 ；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增第二外源基因，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)電泳純化后與PGEMT easy載體相連接， 經(jīng)酶切鑒定，獲得陽性克隆命名為pGEMT/第二外源基因，將第二外源基因片段從pGEMT/第二外源基因上經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切下來，用相同雙酶切處理的pshuttle-Bio-PGK-eG FP-miniCMV-SV40進(jìn)行連接；連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，所獲得的載體為表達(dá)eGFP及第二外源基因的雙向啟動(dòng)子穿梭載體，命名為 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；eGFP及第二外源基因的雙向啟動(dòng)子穿梭載體，命名為 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；將 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因經(jīng) BamHI 及 SfuI雙酶切末端補(bǔ)平后與經(jīng)SwaI酶切的腺病毒pshuttle Ad5_E4-纖維蛋白嵌合體穿梭載體進(jìn)行連接，獲得的陽性克隆為表達(dá)eGFP及第二外源基因的腺病毒pshuttle Ad5-E4_纖維蛋白嵌合體穿梭載體，命名為pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-纖維蛋白嵌合體；(7)制備纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒HBD24-纖維蛋白嵌合體.第一外源基因/第二外源基因用BioI線性化的pshuttle Ad5_CMVeGFP/第二外源基因-E4-纖維蛋白嵌合體的穿梭載體與SwaI線性化的pHBD24-第一外源基因/SwaI腺病毒載體骨架按摩爾比3 1共轉(zhuǎn) KE. coliBJ5183，通過酶切及測(cè)序獲得陽性克隆，所得到的載體命名為pHBD24-纖維蛋白嵌合體.第一外源基因/第二外源基因；采用磷酸鈣法將I^cI線性化的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體PHBD24-纖維蛋白嵌合體.第一外源基因/第二外源基因的轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞系，經(jīng)過7 10天后，離心收獲病毒原液，經(jīng)2 3輪的病毒擴(kuò)增，通過兩次氯化銫密度梯度超速離心純化，獲得純化的纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒HBD24-纖維蛋白嵌合體.第一外源基因/第二外源基因，-80°C冰箱內(nèi)保存。
5.權(quán)利要求1纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療惡性腦膠質(zhì)瘤藥物中的用途。
6.權(quán)利要求1纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療肝癌藥物中的用途。
7.權(quán)利要求1纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療胃癌藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療肺癌藥物中的用途。
9.權(quán)利要求1纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療結(jié)腸癌藥物中的用途。
10.權(quán)利要求1纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療乳腺癌藥物中的用途。
11.權(quán)利要求1纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體在制備治療黑色素瘤藥物中的用途。
全文摘要
一種纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體，在人腺病毒5型基因組922bp-947bp有24bp堿基的缺失；在人腺病毒5型基因組28183bp～29906bp插入表達(dá)第一外源基因的表達(dá)元件、31042bp處插入纖維蛋白嵌合體、32021bp與32022bp插入雙表達(dá)第二外源基因與eGFP的表達(dá)元件。構(gòu)建方法為構(gòu)建pAd5 E1A 24bp缺失的穿梭載體、pHBD24腺病毒載體骨架、pHBDE3-第一外源基因的穿梭載體、pHBDE3-第一外源基因/SwaI條件復(fù)制型腺病毒載體骨架、pshuttle Ad5-E4-纖維蛋白嵌合體穿梭載體、表達(dá)eGFP及第二外源基因的穿梭載體/第二外源基因-E4-纖維蛋白嵌合體序列、制備纖維蛋白修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的溶瘤腺病毒載體。該載體能抑制惡性腦膠質(zhì)瘤、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、黑色素瘤作用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102229962SQ20111013975
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者夏海濱, 李星 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)