專利名稱：臍血造血干細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明方法涉及一種血液制品的制作方法，特別是一種臍血造血干細(xì)胞的制作方法。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞是能夠產(chǎn)生血細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板)和免疫活性細(xì)胞的一類特殊細(xì)胞。紅細(xì)胞負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧氣，白細(xì)胞抵抗入侵的病原微生物，血小板有凝血作用，免疫活性細(xì)胞構(gòu)成人體的免疫防御體系。當(dāng)病人的造血干細(xì)胞受到損害或惡變時(shí)，將正常的造血干細(xì)胞移植到病人體內(nèi)取代異常的造血干細(xì)胞，使之重建正常造血和免疫功能，這是目前治療惡性及非惡性血液病、某些遺傳性病和惡性腫瘤的最有效的方法。對(duì)上述的病癥的一般的治療方法是采用骨髓移植法，骨髓移植的最大障礙是找到一個(gè)組織配型基因完全相同的供者，另外骨髓采集需要使用麻醉劑，會(huì)給供者造成不適，骨髓移植準(zhǔn)備工作耗費(fèi)時(shí)間，影響病人及時(shí)治療。胎兒臍血中含有大量造血細(xì)胞，以臍血作為造血干細(xì)胞移植的新來(lái)源，是20世紀(jì)末醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得的重要成果之一。目前，臍血造干細(xì)胞移植已成功治愈了白血病，嚴(yán)重免疫缺陷癥和某些遺傳性疾病等。由于臍血來(lái)源廣泛對(duì)供者無(wú)任何痛若，取血方法簡(jiǎn)便，和可以血庫(kù)形式長(zhǎng)期保存，便于查詢?nèi)∮眉皶r(shí)方便的優(yōu)點(diǎn)，展望未來(lái)，臍血可能取代骨髓成為造血干細(xì)胞主要來(lái)源，特別是對(duì)兒童病患者。
本

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種臍血造血干細(xì)胞的制作方法，以此方法制作的造血干細(xì)胞可長(zhǎng)期存放于臍血庫(kù)，以便于病人隨時(shí)配組、治療取用，大大地方便了治療，及時(shí)救治病人。此外，本發(fā)明的實(shí)施還會(huì)具有顯著的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明的目的是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。臍血造血干細(xì)胞的制作方法，其特征是它按如下步序進(jìn)行(1)采集臍血，將出生的胎兒的臍血采到臍血采集袋內(nèi)；(2)加入紅細(xì)胞沉淀劑，將紅細(xì)胞沉淀劑加入到臍血采集袋中；(3)離心分離1，用離心方法將臍血采集袋中臍血中的紅細(xì)胞分離；(4)移出紅細(xì)胞，將臍血采集袋中被分離的紅細(xì)胞輸送到紅細(xì)胞收集袋內(nèi)；(5)離心分離2，用離心方法將臍血收集袋中的血漿與白細(xì)胞包括造血干細(xì)胞再一次分離；(6)移出血漿，將臍血采集袋中被分離的血漿輸入到血漿收集袋內(nèi)，臍血收集袋內(nèi)剩余的為含干細(xì)胞的白細(xì)胞；(7)加入冷凍劑，將臍血收集袋中的包括干細(xì)胞的白細(xì)胞中加入冷凍劑；(8)包裝，將含干細(xì)胞的白細(xì)胞包裝；(9)降溫，將包裝的含干細(xì)胞的白細(xì)胞降溫；(10)入庫(kù)保存，入庫(kù)在液氮中保存。
所述步序(2)采用的沉淀劑為6％羥乙基淀粉，按與臍血比例1∶3-5加入。所述步序(7)中冷凍劑為二甲亞砜，與等容積的右旋糖酐40混合預(yù)冷后以1∶4比例加入經(jīng)預(yù)冷的含造血干細(xì)胞的白細(xì)胞中。所述步序(9)的降溫是將包裝有含造血干細(xì)胞的白細(xì)胞的金屬保存盒放在降溫儀內(nèi)，開始降溫速度為8-10℃/分，開始凍結(jié)溫度為-3℃，停止凍結(jié)溫度為-10--15℃，凍結(jié)后降溫速度為2℃/分，終止降溫溫度為-50℃。所述步序(3)的操作是將臍血采集袋的帶有接駁頭的一端朝下放在離心機(jī)中，所述步序(4)的操作是將臍血采集袋帶有接駁頭的一端朝下，用II型連接管從接駁頭引出，經(jīng)I型連接管引到紅細(xì)胞袋中。所述步序(5)的操作是將臍血采集袋的帶有接駁頭的一端朝上安放在離心機(jī)中；所述步序(6)的操作是將臍血采集袋帶有接駁頭的一端朝上，用II型連接管從接駁頭處將血漿引出至血漿袋中。所述的I型連接管包括尖插頭、連管體、支管，尖插頭的尾部與連管體的單端口相連，連管體的另一端具有至少二個(gè)端口，分別經(jīng)支管與紅細(xì)胞袋及血漿袋相連。所述II型連接管包括尖插頭、連管體、支管、分支管、隔膜管，尖插頭的尾部與連管體的單端口相連，連管體的另一端具有若干端口，各端口經(jīng)支管與下一級(jí)連管體相連，在一支管的端頭上具有隔膜管，另一支管的端頭與下一級(jí)連管體的單端口相連。
本發(fā)明方法采用逐步分離的方法將采集到的臍血經(jīng)離心分離將臍血中的血紅細(xì)胞首先分離取出，然后再將血漿分離取出，將含有造血干細(xì)胞的白細(xì)胞加冷凍劑進(jìn)行包裝、冷凍，放入臍血庫(kù)保存，以備隨時(shí)取用。為了防止在各操作、傳遞中產(chǎn)生差錯(cuò)，在每一步序操作之前必須進(jìn)行核查該臍血采集袋，紅細(xì)胞收集袋、以及用于抽取紅細(xì)胞成份的注射器上的標(biāo)記(條碼號(hào))是否一致，同樣在其它操作如加入冷凍劑操作時(shí)也應(yīng)核對(duì)該臍血采集袋、冷凍袋、冷凍保存盒上的標(biāo)記是否一致。
由于上述操作特別是紅細(xì)胞、血漿的移出，抽樣檢測(cè)，加入沉淀劑、冷凍劑等操作，使用常規(guī)的取血方法和注射分離器械已不能確保在操作過(guò)程中不發(fā)生污染，達(dá)不到生物制品GMP的要求。此外，常規(guī)器械在操作中易混亂、工作效率低，計(jì)量不易準(zhǔn)確。采用本發(fā)明提供的制作方法和臍血收集袋、I和II型連接管及其血漿袋、紅細(xì)胞袋，能避免上述普通器械的缺點(diǎn)，達(dá)到不會(huì)發(fā)生污染、不會(huì)發(fā)生血樣混亂，且計(jì)量準(zhǔn)確、工作效率顯著提高的目的。
綜上所述，本發(fā)明由于采用胎兒的臍血為原料，加以處理，制成造血干細(xì)胞，可將其低溫長(zhǎng)期存放在臍血血庫(kù)中，以隨時(shí)根據(jù)病人要求取出使用，避免了采用骨髓移植時(shí)的不易尋找捐贈(zèng)人和即時(shí)移植的種種不便，使病人得到及時(shí)治療。此外，由于臍血造血干細(xì)胞的生產(chǎn)制作在中國(guó)尚處于初創(chuàng)階段，本發(fā)明填補(bǔ)了這方面的空白，本發(fā)明的實(shí)施還將會(huì)改變中國(guó)長(zhǎng)期以來(lái)造血干細(xì)胞來(lái)源缺乏的局面，也會(huì)具有顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1為本發(fā)明的制作流程示意圖，圖2、3、4、5為紅細(xì)胞、血漿移出和添加操作示意圖。
實(shí)施例通過(guò)本實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明臍血造血干細(xì)胞的制作方法。臍血存在于胎盤和與胎兒連接的臍帶血管內(nèi)，在胎兒出生的時(shí)候采集，臍血為造血干細(xì)胞的原材料。按圖1所示步序進(jìn)行制作(1)采集臍血，將胎兒臍血采集到臍血采集袋1內(nèi)；如圖2，該臍血采集袋1一端帶有接駁頭12另端具有懸掛口13和懸掛孔13A用于懸掛，臍血采集袋1內(nèi)裝臍血11，經(jīng)篩選臍血質(zhì)量應(yīng)達(dá)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)施例中，臍血應(yīng)達(dá)到無(wú)病原體感染，未攜帶遺傳病基因，低凝血，和細(xì)胞具有良好的存活能力，檢測(cè)是否達(dá)標(biāo)。
(2)加入紅細(xì)胞沉淀劑，連接臍血采集袋1和II型連接管2，將紅細(xì)胞沉淀劑通過(guò)II型連接管的隔膜管23A或24加入到臍血采集袋內(nèi)，本實(shí)施例采用6％羥乙基淀粉與臍血比例為1∶5，將該沉淀劑注入到臍血采集袋1內(nèi)，充分混勻。
(3)離心1；用離心方法將臍血采集袋1中臍血11中的紅細(xì)胞14分離，本實(shí)施例中采用離心機(jī)，將臍血采集袋帶接駁頭12的一端朝下放入低溫離心機(jī)，離心后，紅細(xì)胞14沉淀在采集袋的帶接駁頭12的一端。
(4)移出紅細(xì)胞，如圖3，將臍血采集袋1中被分離的紅細(xì)胞14輸送到紅細(xì)胞收集袋4內(nèi)。先將臍血采集袋1從離心機(jī)取出，采集袋1的接駁頭12朝下，將與臍血采集袋1相連的I型連接管的紅細(xì)胞收集袋4放在較低的位置，使紅細(xì)胞14從臍血收集袋1的底部緩慢流入紅細(xì)胞收集袋4中。
做法是，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，將血液分離用I型連接管3的尖插頭31與II型連接管的隔膜管24相連，按照離心時(shí)臍血采集袋1朝向的位置，將臍血采集袋1懸掛在墻的勾子上。將連在I型連接管3上的紅細(xì)胞(收集)袋4放在電子秤6上(圖3)。離心后紅細(xì)胞14沉淀下來(lái)，通過(guò)重力和使用止血鉗33控制紅細(xì)胞14從臍血袋1到紅細(xì)胞袋4的流速。當(dāng)紅細(xì)胞量達(dá)到電腦指示的量時(shí)，停止紅細(xì)胞移出，熱合與紅細(xì)胞袋4相連的支管32，分離紅細(xì)胞袋4。
(5)離心2，用離心方法將白細(xì)胞包括造血干細(xì)胞與臍血收集袋中剩余的血漿再一次分離，用離心機(jī)進(jìn)行分離，將臍血采集袋放入低溫離心機(jī)，在離心運(yùn)行后，大于99％的白細(xì)胞包括造血干細(xì)胞與血漿分離。第二次離心時(shí)，將臍血采集袋1的接駁頭12一端朝上(圖4)，離心后，保持上述位置。
(6)移出血漿，將臍血采集袋1從離心機(jī)中取出，將臍血采集袋接駁頭12一端的懸掛孔13A懸掛在分漿器(未示出)上，通過(guò)分漿器上夾板對(duì)臍血采集袋1的壓力，和使用止血鉗33控制血漿15從臍血采集袋1到血漿袋5的流速，當(dāng)含有紅細(xì)胞沉淀液的血漿15的移出量達(dá)到電腦指示的量時(shí)，夾緊與血漿袋5相連的支管32上的夾子33，使臍血采集袋1內(nèi)剩余的為包括造血干細(xì)胞的白細(xì)胞16，即富集白細(xì)胞。
(7)加入冷凍劑，將臍血采集袋1中的富集白細(xì)胞臍血中加入冷凍劑。本實(shí)施例采用的冷凍劑為2.5ml的二甲亞砜(Dimethyl sulphoxide)，將其與等容積的右旋糖酐40(Dextran40)混合后，以混合液按1∶4的比例通過(guò)連接管快速加入到臍血收集袋1內(nèi)的富集白細(xì)胞臍血中，加入之前混合液和富集白細(xì)胞均需預(yù)冷。其操作為血漿移出后，將冷凍袋7通過(guò)II型連接管2與臍血袋1相連(圖5)。從II型連接管的扭斷式隔膜管24處注入5ml冷凍劑后，將含有冷凍劑的濃縮白細(xì)胞16從臍血采集袋1轉(zhuǎn)入冷凍袋7，熱合與II型連接管2相連的支管22后，使冷凍袋7分離。
(8)將冷凍袋7放入FEP塑料保護(hù)袋內(nèi)，真空密合后，裝入冷凍保存盒內(nèi)。
(9)降溫；將冷凍保存盒降溫，放在液氮保存系統(tǒng)的降溫儀的液氮?dú)庀鄬觾?nèi)進(jìn)行降溫，開始降溫速度為10℃/分，開始凍結(jié)溫度為-3℃，停止凍結(jié)溫度為-10℃，凍結(jié)后降溫速度為2℃/分，終止降溫速度為-50℃，(10)入庫(kù)液氮保存；在液氮保存系統(tǒng)內(nèi)自動(dòng)將冷凍保存盒從液氮?dú)庀鄬愚D(zhuǎn)入到液氮的液相層保存，溫度為-196℃。
如圖2，該II型連接管2包括尖插頭21、連管體21A、支管22，分支管23、隔膜管24，尖插頭21的尾部與連管體21A的單端口相連，連管體21A的下端具有若干端口，本實(shí)施例為2個(gè)端口，右端經(jīng)支管22與下一級(jí)連管體21B相連，連管體21B可再下分為多級(jí)隔膜管23A。左端支管22的下端頭為連管體21B，下端可與分支管23、下一級(jí)連管體21C的單端口相連以便形成多級(jí)連管分支，多級(jí)分支的末端為隔膜管24，用于插入該尖插頭或注射器來(lái)抽取或添加之用。如圖3，I型連接管3包括尖插頭31、連管體31B、支管32，尖插頭31的尾部與連管體31B的單端口相連，連管體31B另一端具有二個(gè)端口，分別經(jīng)支管32與紅細(xì)胞袋4及血漿袋5相連。當(dāng)使用時(shí)，如圖3，II型連接管2的尖插頭21插入采血袋1的接駁頭12中，I型連接管3的尖插頭31插入II型連接管2的隔膜管24中，將紅細(xì)胞經(jīng)II型連接管2和I型連接管3的支管32引入到紅細(xì)胞袋4中，或如圖4引入到血漿袋5中。引出重量由電子秤6顯示。由于I、II型連接管均可具有多個(gè)、多級(jí)支管，可同時(shí)連接多個(gè)血漿袋或和紅細(xì)胞袋，使血液分離簡(jiǎn)化、準(zhǔn)確、高效、不致污染。
在上述加工過(guò)程中，各步序操作時(shí)均有檢測(cè)，以免發(fā)生差錯(cuò)，如在步序(1)后留樣檢測(cè)傳染病、血型，如在步序(4)移出紅細(xì)胞后，將移出的紅細(xì)胞進(jìn)行組織配型檢測(cè)。做法是將移出的紅細(xì)胞成份分裝在數(shù)個(gè)冷凍小管內(nèi)，用于組織配型檢測(cè)以備今后應(yīng)用。在步序(6)，移出血漿后，要對(duì)富集白細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，包括檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞成活率、細(xì)胞集落培養(yǎng)等，可按常規(guī)做法辦理。在步序(8)之后，進(jìn)行檢測(cè)步序(81)，先將冷凍袋內(nèi)含冷凍劑的細(xì)胞液返回到步序(7)的臍血袋1內(nèi)，再送回冷凍袋，接著進(jìn)行檢測(cè)步序(82)，將血漿袋內(nèi)的血漿返回臍血袋，再將血漿送到血漿袋，目的是檢測(cè)干細(xì)胞在處理過(guò)程時(shí)經(jīng)過(guò)的所有途徑是否受到病原菌污染，以保證干細(xì)胞的質(zhì)量。又如在步序(8)富集白細(xì)胞轉(zhuǎn)入冷凍袋之前也需進(jìn)行細(xì)胞成活率檢測(cè)，以保證質(zhì)量。管理上的措施是防止同時(shí)處理二份以上臍血時(shí)發(fā)生混亂，導(dǎo)致惡性事故發(fā)生，一般在各主要步序均經(jīng)核查，要有第二者進(jìn)行核查臍血采集袋、紅細(xì)胞收集袋、及用于抽取紅細(xì)胞成份的注射器上的條碼號(hào)是否一致。核查紅細(xì)胞收集袋、用于抽取紅細(xì)胞成份的注射器及儲(chǔ)存試管上的條碼是否一致，以免出錯(cuò)。在步序(8)要由第二者進(jìn)行核查該臍血袋、冷凍袋、冷凍保存盒上的條碼是否一致。在各個(gè)步序中均設(shè)有登記表，按要求登記以方便管理避免出錯(cuò)。此外，本發(fā)明方法的各步序均可采用電腦控制，特別是重量配比，各操作參數(shù)控制、各種試管、注射器等配套識(shí)別，以及試驗(yàn)取得的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)，則可大大節(jié)省一些煩瑣的核查登記工作。
權(quán)利要求
1.臍血造血干細(xì)胞的制作方法，其特征是它按如下步序進(jìn)行(1)采集臍血，將出生的胎兒的臍血采到臍血采集袋內(nèi)；(2)加入紅細(xì)胞沉淀劑，將紅細(xì)胞沉淀劑加入到臍血采集袋中；(3)離心分離1，用離心方法將臍血采集袋中臍血中的紅細(xì)胞分離；(4)移出紅細(xì)胞，將臍血采集袋中被分離的紅細(xì)胞輸送到紅細(xì)胞收集袋內(nèi)；(5)離心分離2，用離心方法將臍血采集袋中的血漿與白細(xì)胞包括造血干細(xì)胞再一次分離；(6)移出血漿，將臍血采集袋中被分離的血漿輸入到血漿收集袋內(nèi)，臍血采集袋內(nèi)剩余的為含造血干細(xì)胞的白細(xì)胞；(7)加入冷凍劑，將臍血采集袋中的含造血干細(xì)胞的白細(xì)胞中加入冷凍劑；(8)包裝，將加入冷凍劑的含造血干細(xì)胞的白細(xì)胞包裝；(9)降溫，將加入冷凍劑的含造血干細(xì)胞的白細(xì)胞降溫；(10)入庫(kù)保存，入庫(kù)在液氮中保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍血造血干細(xì)胞的制作方法，其特征是所述步序(2)采用的沉淀劑為6％羥乙基淀粉，按與臍血比例1∶3-5加入。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述臍血造血干細(xì)胞的制作方法，其特征是所述步序(7)中冷凍劑為二甲亞砜，與等容積的右旋糖酐40混合預(yù)冷后以1∶4比例加入經(jīng)預(yù)冷的含造血干細(xì)胞的白細(xì)胞中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述臍血造血干細(xì)胞的制作方法，其特征是所述步序(9)的降溫是將包裝有含造血干細(xì)胞的白細(xì)胞的金屬保存盒放在降溫儀內(nèi)，開始降溫速度為8-10℃/分，開始凍結(jié)溫度為-3℃，停止凍結(jié)溫度為-10--15℃，凍結(jié)后降溫速度為2℃/分，終止降溫溫度為-50℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述臍血造血干細(xì)胞的制作方法，其特征是所述步序(3)的操作是將臍血采集袋的帶有接駁頭的一端朝下放在離心機(jī)中，所述步序(4)的操作是將臍血采集袋帶有接駁頭的一端朝下，用II型連接管從接駁頭引出，經(jīng)I型連接管引到紅細(xì)胞袋中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述臍血造血干細(xì)胞的制作方法，其特征是所述步序(5)的操作是將臍血采集袋的帶有接駁頭的一端朝上安放在離心機(jī)中；所述步序(6)的操作是將臍血采集袋帶有接駁頭的一端朝上，用II型連接管從接駁頭處將血漿引出至血漿袋中。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法中使用的連接管，其特征是所述的I型連接管包括尖插頭、連管體、支管，尖插頭的尾部與連管體的單端口相連，連管體的另一端具有至少二個(gè)端口，分別經(jīng)支管與紅細(xì)胞袋及血漿袋相連。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法中使用的連接管，其特征是所述II型連接管包括尖插頭、連管體、支管、分支管、隔膜管，尖插頭的尾部與連管體的單端口相連，連管體的另一端具有若干端口，各端口經(jīng)支管與下一級(jí)連管體相連，在一支管的端頭上具有隔膜管，另一支管的端頭與下一級(jí)連管體的單端口相連。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍血造血干細(xì)胞的制作方法，其特征是在步序(4)移出紅細(xì)胞后，將移出的紅細(xì)胞進(jìn)行組織配型檢測(cè)，做法是將移出的紅細(xì)胞分裝在數(shù)個(gè)儲(chǔ)存試管內(nèi)進(jìn)行組織配型檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍血造血干細(xì)胞的制作方法，其特征是在步序(8)之后的檢測(cè)(81)為先將冷凍袋內(nèi)含冷凍劑的細(xì)胞液返回到步序(7)的臍血袋內(nèi)，再送回冷凍袋，接著進(jìn)行檢測(cè)(82)為將血漿袋內(nèi)的血漿返回到臍血袋，再將血漿送到血漿袋。
全文摘要
臍血造血干細(xì)胞的制作方法，按如下步序進(jìn)行(1)采集臍血，將出生的胎兒的臍血采到臍血采集袋內(nèi)；(2)加入紅細(xì)胞沉淀劑；(3)離心分離1，將臍血采集袋中臍血中的紅細(xì)胞分離；(4)移出紅細(xì)胞，將紅細(xì)胞輸送到紅細(xì)胞收集袋內(nèi)；(5)離心分離2，將白細(xì)胞包括造血干細(xì)胞與血漿再一次分離；(6)移出血漿，將被分離的血漿輸入到血漿收集袋內(nèi)，臍血收集袋內(nèi)剩余的臍血為含富集白細(xì)胞的臍血；(7)加入冷凍劑，將臍血收集袋中的富集白細(xì)胞臍血中加入冷凍劑；(8)包裝；(9)降溫；(10)入庫(kù)保存。用本發(fā)明方法制作的造血干細(xì)胞可長(zhǎng)期存放，以便于隨時(shí)取用，大大地方便了治療，及時(shí)解除病人痛苦，適用于制作在臍血庫(kù)中長(zhǎng)期存放的造血干細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K35/14GK1436843SQ0210367
公開日2003年8月20日 申請(qǐng)日期2002年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月8日
發(fā)明者劉頡 申請(qǐng)人:劉頡