專(zhuān)利名稱(chēng)：一種治療出血性大腸桿菌感染的液體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及在醫(yī)學(xué)上治療腹瀉病的一種治療出血性大腸桿菌感染的液體。
背景技術(shù)：
出血性大腸桿菌感染可引起人的嚴(yán)重病患，嚴(yán)重威脅人的身體健康和正常的生活，已在全球流行10余年。為解決由于出血性大腸桿菌感染引起的腹瀉和一系列的并發(fā)癥，醫(yī)務(wù)工作者和科研人員從事了大量的工作，也取得了一定的成效，例如我國(guó)早已從腹瀉人的糞便中分離出該病原，許多生物公司有該菌株出售，用于臨床和科研。但是由于出血性大腸桿菌易產(chǎn)生毒素，在臨床治療應(yīng)用中抗生素往往會(huì)誘導(dǎo)毒素更多的釋放，導(dǎo)致病人腎衰和溶血性尿毒綜合癥，嚴(yán)重影響患者的生命。因此，如何有效地治療因出血性大腸桿菌感染引起的疾病一直未有得到很好解決。

發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述情況，本發(fā)明目的在于為解決出血性大腸桿菌感染引起的疾病的技術(shù)問(wèn)題而提供一種治療出血性大腸桿菌感染的液體，可很好地用于因出血性大腸桿菌感染而引起的血便、稀便、腹痛、發(fā)熱惡心、嘔吐、厭食、無(wú)力、腹瀉等；本發(fā)明是用環(huán)境污水加入已培養(yǎng)好的出血性大腸菌標(biāo)準(zhǔn)菌液，在適當(dāng)溫度下，一定時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)后離心得到培養(yǎng)液體，再用無(wú)菌濾膜過(guò)濾得上清母液，以LB肉湯為增殖液，以增殖液與母液、出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液以50∶1∶1的配比進(jìn)行混合培養(yǎng)、離心、再無(wú)菌過(guò)濾，使其效價(jià)濃度≥107Pfu/ml，即成所需口服液體；該發(fā)明生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單，原材料豐富，成本低，臨床應(yīng)用效果好，可有效地用于因出血性大腸桿菌感染引起的腸道疾病，預(yù)防出血性大腸桿菌感染，恢復(fù)由厭食、無(wú)力、腹瀉導(dǎo)致的系列體征。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。
用細(xì)菌總數(shù)及大腸桿菌超標(biāo)的污水與已培養(yǎng)的出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液，以50∶1的比例，將出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液加入到污水中，在35-37℃的溫度下，經(jīng)5-7小時(shí)培養(yǎng)后，用離心機(jī)離心，再用微孔無(wú)菌濾膜過(guò)濾得上清母液，濃度為107pfu/ml，再以LB肉湯作增殖液，以增殖液與出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液、母液以50∶1∶1的比例混合培養(yǎng)，在35-37℃的溫度下培養(yǎng)5-7小時(shí)，由離心機(jī)離心，用無(wú)菌濾膜過(guò)濾，得濾液即為本發(fā)明液體，可口服用于治療。
以50ml污水制備一種治療出血性大腸桿菌感染的液體為例，其具體情況是用農(nóng)村或城市生活中的細(xì)菌總數(shù)超過(guò)1000個(gè)/ml、大腸桿菌群數(shù)超過(guò)18個(gè)/升的環(huán)境污水(或嚴(yán)重超過(guò)國(guó)家生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的污水)50ml(ml為毫升，以下同)，加入1ml已培養(yǎng)2小時(shí)的出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液，例如市售標(biāo)準(zhǔn)菌0157H7，如北京陸橋醫(yī)學(xué)生物技術(shù)中心生產(chǎn)的ATCC43888的標(biāo)準(zhǔn)菌液0157H7大腸桿菌也為國(guó)際通用，在36℃的溫度下，經(jīng)過(guò)6個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)，之后用4000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)進(jìn)行離心1小時(shí)，再用0.45μm微孔無(wú)菌濾膜過(guò)濾，濃度107pfu/ml，取上清液作為母液進(jìn)行增殖(約得濾液45-48ml)，以LB肉湯(由國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的LB肉湯)為增殖液，在50ml增殖液中加入1ml的出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液及1ml的母液進(jìn)行混合培養(yǎng)，在36℃的溫度下培養(yǎng)6小時(shí)，再用4000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)進(jìn)行離心1小時(shí)后，用0.45μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾，使?jié)舛取?07pfu/ml，經(jīng)檢測(cè)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，無(wú)殘?jiān)?，即為成品口服液體，裝瓶后可存放于4℃的環(huán)境中(如4℃的冰箱內(nèi))待用。
本發(fā)明液體可根據(jù)需要，以上述比例增殖任何量的口服液體，既可大批生產(chǎn)，又可試驗(yàn)室制備，其液體清晰透明、無(wú)色、無(wú)味，無(wú)毒副作用，可有效地用于臨床治療因出血性大腸桿菌感染引起的腸道疾病，并有顯著的效果，經(jīng)臨床試用，深受歡迎。
以下就有關(guān)問(wèn)題作詳細(xì)說(shuō)明。
一、液體檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及功能本發(fā)明經(jīng)按國(guó)家中國(guó)藥典2000年版一部附錄11頁(yè)部頒標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)測(cè)，完全符合要求；其功能可在腸道內(nèi)快速殺滅、溶解所對(duì)應(yīng)治療的出血性大腸桿菌致病菌，使腹瀉停止，有效阻止腸道致病菌的繁殖、粘附及對(duì)腸粘膜的損害，主治由出血性大腸桿菌感染引起的血便、稀便、腹瀉，使發(fā)熱、惡心、嘔吐癥狀消失，并可預(yù)防出血性大腸桿菌的感染，恢復(fù)由厭食、無(wú)力、腹瀉引起的系列體征。
二、液體的純化為了保證該發(fā)明液體的有效服用，有時(shí)需對(duì)液體進(jìn)行多次純化，其方法是首先用醫(yī)學(xué)上常用的斑點(diǎn)試驗(yàn)法檢測(cè)該液體的效價(jià)，即將標(biāo)準(zhǔn)出血性大腸桿菌放入2mlLB肉湯，在36℃溫度下生長(zhǎng)1小時(shí)，將菌液均勻地鋪在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，在36℃下烘干，馬上滴1∶10、1∶100、1∶1000......不同稀釋度的母液，在37℃下置24小時(shí)，次日某個(gè)最高稀釋度出現(xiàn)透明的噬斑，該濃度即為母液的效價(jià)。用已測(cè)定的效價(jià)濃度管使其稀釋成10-4，10-5、10-6、10-7......，用雙層瓊脂法作單斑分離，另配0.35％的軟瓊脂放于55℃的水浴，純化時(shí)，將培養(yǎng)2小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)出血性大腸桿菌液0.1ml和上述不同稀釋度的母液0.1ml同時(shí)加入軟瓊脂管中，混勻，倒于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿，待凝固后放在37℃的溫度下過(guò)夜培養(yǎng)(12-24小時(shí))，可如此多作幾個(gè)稀釋度，次日檢查，一個(gè)平板上有透明、大小均勻的噬斑50-100個(gè)為純化合格，用接種針挑取噬斑中央部分，放于小試管LB肉湯內(nèi)，如果噬斑大小均勻，一次純化即可成所需口服液體，如果噬斑不出現(xiàn)或大小不等，可再連續(xù)純化一次、二次，直至液體達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。
所說(shuō)的LB肉湯是由國(guó)家規(guī)定的由蛋白胨10克、酵母粉5克、氯化鈉(Nacl)10克加入1000ml水制成。
Pfu濃度測(cè)定。因本發(fā)明液體濃度(噬斑點(diǎn)濃度)pfu要求溶液效價(jià)≥107pfu/ml，該要求是一個(gè)很重要的技術(shù)問(wèn)題，必須加以測(cè)定，其測(cè)定方法是，將數(shù)支0.35％的軟瓊脂加熱熔化，放于55℃的水中，將母液稀釋成10-2、10-4、10-6、10-7、10-8、10-9......，每管加入0.1ml標(biāo)準(zhǔn)出血性大腸桿菌液，混合，然后分別加入0.35％軟瓊脂中，分別倒入數(shù)個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，在35℃下過(guò)夜(12-24小時(shí))，次日計(jì)錄最高稀釋管所呈現(xiàn)的透明班點(diǎn)，乘以稀釋倍數(shù)，即為液體的pfu濃度，作為本發(fā)明治療疾病使用，若pfu濃度太高，可以用LB肉湯稀釋。
三、療效觀察資料1、選擇病例的標(biāo)準(zhǔn)患有急性水樣便或血樣便；糞便中檢出出血性大腸桿菌；腹瀉若干天后繼發(fā)少尿等急性腎衰的前期為治療對(duì)象，凡符合上述其中兩癥狀者均可入選。
2、診斷標(biāo)準(zhǔn)患者先有水樣便，繼而有類(lèi)似下消化道出血的血樣糞便，腹痛，發(fā)燒，惡心，嘔吐，每日大便在3次以上，可在糞便中查出出血性大腸病原菌，或者恢復(fù)期血清抗體4倍升高者，確診為出血性大腸桿菌感染者，并對(duì)其進(jìn)行治療。
3、治療方案在治療前首先對(duì)病人出現(xiàn)水樣便或血樣便采集作大便病原分離，糞便采取后，同時(shí)用本發(fā)明口服液體進(jìn)行治療，每日2次，每次10ml，并在治療時(shí)設(shè)對(duì)照組，對(duì)照組用LB肉湯作安慰劑，7天為一個(gè)療程。
4、療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)按照國(guó)家衛(wèi)生部1993年制訂的藥物治療原則，確立臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)和試驗(yàn)病例標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，其療效評(píng)定分為全愈、有效、無(wú)效，其中全愈為腹瀉停止，血便消失，大便正常，糞便中檢不出病原菌，體力恢復(fù)，腹痛消失，飲食正常，精神恢復(fù)者；有效為臨床癥狀得到改善，上述各癥狀其中有消失者；無(wú)效為臨床癥狀無(wú)明顯改善者，糞便中仍能分離出病原菌，或者加重病情者。
5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理情況本發(fā)明藥液經(jīng)臨床應(yīng)用取得了滿(mǎn)意的效果，具85例病人服用有效率在99％，僅有一例無(wú)明顯效果，但病情也未加重。為進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明液體，經(jīng)對(duì)60只乳豬(雌雄各半)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明組與對(duì)照組有明顯差異。對(duì)照組用LB肉湯作安慰劑。試驗(yàn)方法是對(duì)健康的60只乳豬各選30只，同時(shí)灌以有出血性大腸桿菌感染的食物，使其發(fā)病，經(jīng)觀察48-72小時(shí)內(nèi)陸續(xù)發(fā)病，隨用兩組進(jìn)行對(duì)比治療，結(jié)果如下表一 動(dòng)物感染出血性大腸桿菌生存狀況
表二 動(dòng)物感染出血性大腸桿菌病程狀況
由上述可知，本發(fā)明液體對(duì)治療出血性大腸肝菌引起的腹瀉有非常好的療效，一天即能控制癥狀，對(duì)照組用安慰劑至少3天，且癥狀嚴(yán)重，消瘦，可有死亡發(fā)生。而且若預(yù)先給予本發(fā)明液體，則還有阻止動(dòng)物發(fā)生腹瀉厭食之體征。
經(jīng)對(duì)兩組動(dòng)物解剖對(duì)比，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明液體組對(duì)動(dòng)物肝、腎、脾、腸未導(dǎo)致有任何明顯改變，而對(duì)照組可發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的肝臟充血，腸子充氣，腫脹，腎臟有淤斑，體重有明顯下降，二者有顯著差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P＜0.05，具有可對(duì)比性。
6、結(jié)論從上述情況，不難看出，本發(fā)明液體對(duì)治療出血性大腸桿菌感染有突出療效，無(wú)毒副作用，使用安全，具有推廣應(yīng)用價(jià)值，并可對(duì)治療出血性大腸桿菌感染作出創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，造福于人類(lèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療出血性大腸桿菌感染的液體，其特征在于用細(xì)菌總數(shù)及大腸桿菌超標(biāo)的污水與出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液，以50∶1的比例，將出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液加入到污水中，在35-37℃的溫度下，經(jīng)5-7小時(shí)培養(yǎng)后，用離心機(jī)離心，再用微孔無(wú)菌濾膜過(guò)濾得上清母液，濃度為107pfu/ml，再以LB肉湯做增殖液，以增殖液與出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液、母液以50∶1∶1的比例混合培養(yǎng)，在35-37℃的溫度下，培養(yǎng)5-7小時(shí)，由離心機(jī)離心，用無(wú)菌濾膜過(guò)濾，得液體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療出血性大腸桿菌感染的液體，其特征在于用細(xì)菌總數(shù)超過(guò)1000個(gè)/ml、大腸桿菌群數(shù)超過(guò)18個(gè)/升的污水50ml加入1ml已培養(yǎng)2小時(shí)的出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液，在36℃的溫度下，經(jīng)6個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)，之后用4000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)進(jìn)行離心1小時(shí)，再用0.45μm微孔無(wú)菌濾膜過(guò)濾，濃度107pfu/ml，取上清液作為母液進(jìn)行增殖，以LB肉湯為增殖液，在50ml增殖液中加入1ml的出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液及1ml的母液進(jìn)行混合培養(yǎng)，在36℃的溫度下培養(yǎng)6小時(shí)，再用4000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)離心1小時(shí)，用0.45μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾，得濃度≥107Pfu/ml的液體。
全文摘要
本發(fā)明是一種治療出血性大腸桿菌感染的液體,它是用污水與出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液以50∶1的比例,在一定溫度下經(jīng)培養(yǎng)、離心、過(guò)濾得上清母液后,以LB肉湯做增殖液,再以增殖液、出血性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液、母液以50∶1∶1的比例混合培養(yǎng)、離心、過(guò)濾得的液體,口服用于治療,可有效地用于解決因出血性大腸桿菌感染而引起的疾病問(wèn)題,其生產(chǎn)簡(jiǎn)單,原材料豐富,成本低,無(wú)毒副作用,治療效果好,其推廣應(yīng)用必為治療大腸桿菌感染作出創(chuàng)造性貢獻(xiàn),造福于人類(lèi)。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1366886SQ0113824
公開(kāi)日2002年9月4日 申請(qǐng)日期2001年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月29日
發(fā)明者王建陽(yáng) 申請(qǐng)人:王建陽(yáng)