人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于病理學【技術領域】，具體涉及人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法。本發(fā)明要解決的技術問題是為人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)提供一種新選擇。本發(fā)明的技術方案是人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法，包括如下步驟：a、消毒；b、分離表皮與真皮；c、收集；d、培養(yǎng)；e、傳代。本發(fā)明方法可將人表皮干細胞至少能傳到8代，極大提高了細胞擴增倍數(shù)。
【專利說明】人表皮干細胞的分罔與培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于病理學【技術領域】，具體涉及人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]皮膚是人體最大的組織器官，覆蓋于人體的外表，具有抵御微生物入侵、防止紫外線輻射及水分丟失、調節(jié)體溫，維持外貌等重要功能，是燒傷、創(chuàng)傷外科研究的主要內容。正常皮膚的自我更新及受損皮膚的修復是由多種類型的于細胞共同作用的結果，是維持正常的組織結構和細胞內環(huán)境穩(wěn)定的基本要求。在燒、創(chuàng)傷方面，表皮干細胞擁有無可質疑的潛能，它是皮膚組織特異性干細胞，在維持表皮自我更新、保持皮膚正常的表皮結構與功能及創(chuàng)面修復和皮膚重建方面起著重要作用。然而，體外培養(yǎng)表皮干細胞卻遲遲不能應用到臨床。傳統(tǒng)人表皮干細胞培養(yǎng)方法因需與3T3滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)以及需添加血清，方法復雜、條件較難一致、穩(wěn)定性差、細胞分化快，一般只能傳到3-5代細胞擴增數(shù)量有限；因有滋養(yǎng)細胞影響，也無法應用到臨床上。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術問題是為人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)提供一種新選擇。
[0004]本發(fā)明的技術方案是人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0005]a、消毒:將包皮環(huán)切術取下的人包皮組織用0.5%碘伏浸泡I~2min，PBS (磷酸緩沖液)漂洗至肉眼觀察不再有碘伏著色；
[0006]b、分離表皮與真皮:修剪掉皮下脂肪組織，組織修剪為約為0.5cmX Icm大小的皮片；加入0.25%的 中性蛋白酶II溶液充分覆蓋組織塊，4°C消化12~16h ;棄中性蛋白酶II溶液，PBS (磷酸緩沖液)清洗后用眼科鑷子分離表皮與真皮，得到表皮組織；
[0007]C、收集:剪碎表皮組織，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化5~lOmin，終止消化，過濾，離心，PBS洗滌，收集細胞；
[0008]d、培養(yǎng):用K-SFM培養(yǎng)液將收集的細胞制成2.5 X IO5個/mL的單細胞懸液，接種單細胞懸液于包被了 IV型膠原的培養(yǎng)器皿中，37°C靜置IOmin ;棄未貼壁細胞，用PBS漂洗，加入K-SFM培養(yǎng)液；37°C、5%C02培養(yǎng)；次日更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每2天換液I次；
[0009]e、傳代:待細胞生長密度為70~80%時，用0.25%胰蛋白酶消化，終止消化，離心，收集細胞，按細胞接種面積擴大4~6倍傳代；
[0010]上述所有操作均在無菌條件下進行。
[0011]其中，步驟b中所述的0.25%的中性蛋白酶II的配置方法為，0.5g中性蛋白酶II溶入IOOmL0.1MPBS中，攪拌溶解，過濾，_20°C保存。
[0012]其中，步驟d中所述的K-SFM培養(yǎng)液包含下述成分:重組人表皮生長因子rEGF0.1~0.2ng/mL,牛垂體提取物BPE20~30 μ g/mL ；CaCl20.05mM ;青霉素、鏈酶素均為100U/mL。
[0013]其中，步驟d中所述的包被了 IV型膠原的培養(yǎng)器皿采用如下方法制備:按照10 μ g/cm2計算，將適量0.lmg/mL的IV型膠原溶液加入細胞培養(yǎng)器皿中，是液體充分覆蓋培養(yǎng)器皿的培養(yǎng)面，4°C放置約12~24小時，使用前采用PBS清洗。
[0014]其中，步驟e中進行消化前去掉原培養(yǎng)液，并用PBS清洗細胞。
[0015]其中，步驟e中消化是指在37°C、5%C02下培養(yǎng)6~10分鐘。
[0016]其中，所述的終止消化采用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。
[0017]其中，所述的離心為1000rpm/min條件下離心5min。
[0018]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明方法具有快速、高效、方法簡便、細胞活性高、細胞干性強等特點。采用本發(fā)明方法培養(yǎng)人表皮干細胞至少能傳到8代，極大提高了細胞擴增倍數(shù)；且分化控制好、細胞成分單一，因而具備了應用到臨床上的基本條件。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為分離培養(yǎng)人表皮干細胞細胞生長形態(tài)示意圖；a為接種細胞后第一天貼壁細胞形態(tài)200倍；b為培養(yǎng)7天后小細胞克隆散在分布圖片200倍；c為12~14天細胞克隆融合后圖片200倍；d為高倍鏡下細胞形態(tài)400倍。
[0020]圖2為第8代分離培養(yǎng)人表皮干細胞細胞生長形態(tài)示意圖。
[0021]圖3為蛋白質印跡法檢測表皮干細胞標志物CK19及β I整合素的表達示意圖。
[0022]圖4為激光共聚 焦顯微鏡觀察分離培養(yǎng)細胞中β I整合素和ckl9的表達示意圖；C圖為A圖和B圖的融合；F圖為D圖和E圖的融合。
[0023]圖5為流式細胞儀檢測分離培養(yǎng)細胞表皮干細胞標準物a 6-1ntegrin及⑶71的表達示意圖。
[0024]圖6為克隆形成實驗檢測表皮干細胞克隆形成能力示意圖。
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明的技術方案是人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0026]a、消毒:將包皮環(huán)切術取下的人包皮組織用0.5%碘伏浸泡I~2min，PBS漂洗至肉眼觀察不再有碘伏著色；
[0027]b、分離表皮與真皮:修剪掉皮下脂肪組織，組織修剪為約為0.5cmX Icm大小的皮片；加入0.25%的中性蛋白酶II溶液充分覆蓋組織塊，4°C消化12~16h ;棄中性蛋白酶II溶液，PBS (磷酸緩沖液)清洗后用眼科鑷子分離表皮與真皮，得到表皮組織；
[0028]C、收集:剪碎表皮組織，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化5-10min，終止消化，過濾，離心，PBS洗滌，收集細胞；
[0029]d、培養(yǎng):用K-SFM培養(yǎng)液將收集的細胞制成2.5 X IO5個/mL的單細胞懸液，接種單細胞懸液于包被了 IV型膠原的培養(yǎng)器皿中，37°C靜置IOmin ;棄未貼壁細胞，用PBS漂洗，加入K-SFM培養(yǎng)液；37°C、5%C02培養(yǎng)；次日更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每2天換液I次；
[0030]e、傳代:待細胞生長密度為70~80%時，用0.25%胰蛋白酶消化，終止消化，離心，收集細胞，按細胞接種面積擴大4-6倍傳代；
[0031 ] 上述所有操作均在無菌條件下進行。
[0032]其中，步驟b中所述的0.25%的中性蛋白酶II的配置方法為，0.5g中性蛋白酶II溶入IOOmL0.1MPBS中，攪拌溶解，過濾，_20°C保存。[0033]其中，步驟d中所述的K-SFM培養(yǎng)液包含下述成分:重組人表皮生長因子rEGF0.1~0.2ng/mL,牛垂體提取物BPE20~30 μ g/mL ；CaCl20.05mM ;青霉素、鏈酶素均為100U/mL。
[0034]其中，步驟d中所述的包被了 IV型膠原的培養(yǎng)器皿采用如下方法制備:按照10 μ g/cm2計算，將適量0.lmg/mL的IV型膠原溶液加入細胞培養(yǎng)器皿中，是液體充分覆蓋培養(yǎng)器皿的培養(yǎng)面，4°C放置約12~24小時，使用前采用PBS清洗。
[0035]其中，步驟e中進行消化前去掉原培養(yǎng)液，并用PBS清洗細胞。
[0036]其中，步驟e中消化是指在37°C、5%C02下培養(yǎng)6~10分鐘。
[0037]其中，所述的終止消化采用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。
[0038]其中，所述的離心為1000rpm/min條件下離心5min。
[0039]本發(fā)明中，包皮組織通過0.25%的中性蛋白酶II和0.25%胰酶兩步消化，采用IV型膠原快速黏附法收集表皮干細胞，用K-SFM無血清角質細胞專用培養(yǎng)基(K-SFM培養(yǎng)液)培養(yǎng)。
[0040]本發(fā)明中，所采用的人包皮組織取于12~20歲健康青年包皮環(huán)切術后無傳染、感染性疾病包皮。
[0041]本發(fā)明中IV型膠原包被了的培養(yǎng)器皿使用前應用PBS清洗。
[0042]本發(fā)明中應盡量修剪掉皮下脂肪組織，只留表皮和真皮層；組織塊大小
0.5cmXlcm較合適 。加入0.25%的中性蛋白酶II溶液應充分覆蓋組織塊，否則下一步用鑷子分離表皮、真皮很困難。用鑷子分離表皮與真皮層時需特別注意保護表皮完整性，盡量避免真皮成分脫落(否則可致成纖維細胞污染)。細胞傳代時細胞生長密度不應過大，否則易出現(xiàn)接觸性分化；采用0.25%胰酶消化6~10分鐘，消化效果及細胞消化后活性均良好。傳代次數(shù)可根據(jù)需要選擇。
[0043]實施例1采用本發(fā)明方法培養(yǎng)人表皮干細胞
[0044](I)將取下的人包皮組織用0.5%碘伏浸泡一分鐘，PBS徹底漂洗兩次至肉眼觀察不再有碘伏著色。包皮組織來自第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院泌尿外科12~20歲行包皮環(huán)切術無泌尿系感染等疾病患者(患者知情同意)；
[0045](2)無菌條件下盡量修剪掉皮下脂肪組織，組織修剪為約0.5cmXlcm大小的皮片。
[0046](3)加入0.25%的中性蛋白酶II溶液充分覆蓋組織塊，4°C消化12~16h ；0.25%的中性蛋白酶II的配置及使用方法為，0.5gDispaseII (Roche)溶入IOOmL0.1MPBS，4°C、過夜，再攪拌促溶解0.22um過濾，分裝IOml/瓶，-20°C，保存；
[0047](4)吸棄中性蛋白酶II溶液，PBS清洗后用眼科鑷輕輕牽扯組織，分離表皮與真皮；分離表皮與真皮層時需特別注意保護表皮完整性，盡量避免真皮成分脫落(否則可致成纖維細胞污染);
[0048](5)收集并剪碎表皮組織，加入0.25%胰蛋白酶溶液于37°C消化IOmin ；
[0049](6)加入含10%小牛血清RPMI164010mL終止消化后，吹打成混懸液，200目篩網研磨過濾；
[0050](7) 1000rpm/min條件下離心5min以收集細胞；
[0051](8)棄去上清液后，PBS洗滌一次；[0052](9)加入K-SFM并輕柔吹打制成2.5X 105/mL單細胞懸液，接種4mL單細胞懸液于預先包被了 IV型膠原的25cm2培養(yǎng)瓶中，37°C靜置IOmin ;無血清角質細胞專用培養(yǎng)基K-SFM 配置方法為，K-SFM(Invitrogenl0725):加入 rEGF: (0.1 ~0.2)ng/mL, ΒΡΕ: (20 ~30) μ g/mL ;加入CaC120.05mM ;雙抗(青酶素+鏈酶素)100U/mL ；IV型膠原包被培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板的方法為，按照?ο μ g/cm2計算，將適量0.lmg/mL的IV型膠原溶液加入細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，保證液面能夠充分覆蓋培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板底部即可；放置4°C冰箱，過夜(約12小時)或更長時間。使用前應用PBS液清洗IV型膠原包被了的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板；
[0053](10)吸去上層細胞懸液，用PBS輕輕漂洗兩次，加入適量4mLK_SFM ；
[0054](11) 37°C、5%C02孵箱培養(yǎng)(常規(guī)培養(yǎng))；
[0055](12)次日更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，每2天換液I次。
[0056](13)待細胞生長密度為70~80%時，進行細胞傳代，包括如下步驟:
[0057]a、吸棄原細胞培養(yǎng)基，PBS洗2次；
[0058]b、加入0.25%胰酶I~L 5mL，37°C、5%C02孵箱孵育6~10分鐘(鏡下觀察大部分細胞脫落時終止消化);
[0059]C、加入含10%小牛血清RPMI164010mL終止消化后，吹打成單細胞混懸液；
[0060]d、移入離心管中，1000rpm/min條件下離心5min以收集細胞；
[0061]e、按1: 5傳，加入K-SFM培養(yǎng)液；常規(guī)培養(yǎng)，共傳代8次。
[0062]細胞形態(tài)請見圖1和圖2。
[0063]實施例2原代培養(yǎng)人表皮干細胞鑒定
[0064](一)WB檢測分離培養(yǎng)細胞中表皮干細胞標志物β I整合素和ckl9蛋白的表達。
[0065]①蛋白的提取及定量:以濃度IO5個/mL接種6孔板，每孔接種lmL，細胞密度達到80%后提取細胞總蛋白質，具體操作步驟如下:
[0066]I)倒掉培養(yǎng)基后，將細胞用0.1MPBS清洗兩次，用加樣槍吸凈PBS后每孔加入200 μ L0.25%胰酶，消化約5分鐘，每孔加入lmLPBS，吹打，用吸管將細胞懸液轉移至離心管，800轉，10分鐘后棄上清，每管加入RIPA250y L，PMSF5 μ L，置于冰上消化10分鐘。
[0067]2)將所有細胞懸液轉移至1.5mLEP管中，進行超聲裂解細胞。
[0068]3)4°C低溫高速離心，12000g,30分鐘。
[0069]4)吸取上清，并做好標記。
[0070]5)蛋白定量:(BAC法蛋白定量)準確稱取IOmg的標準蛋白(常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白)加蒸餾水溶解，定容到lOOmL。取6支試管分別編號為O~5，分別加入標準蛋白溶液0，20，40，60，80，100 μ L，并用蒸餾水補足體積到100 μ L。各試管加入工作液2mL,混勻，37°C水浴保溫30min。在分光光度計上，以O管為參比，測定各管樣品在562nm的吸光度值。以蛋白濃度為橫座標，吸光度為縱座標，繪制標準曲線。取樣品溶液IOOyLJf測得的吸光度值代入上述標準曲線，并計算蛋白濃度。如果樣品的濃度過高，可用水做適當?shù)南♂尅?br> `[0071]② western 印記
[0072]I)制備分離膠及濃縮膠，按順序每個加樣孔加入10 μ g蛋白樣品，3 μ LMarker,并做好標記。
[0073]2)電泳時先80V30分鐘，再100V1小時30分鐘。[0074]3)用轉移緩沖液洗滌膠和膜，將膜鋪在膠上，用5mL的移液管在膠上來回的滾動驅除所有的氣泡，在膠/膜外再包一張3_的濾紙(預先用轉移緩沖液侵泡)，將膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。將此濾紙/膠/膜濾紙放入電泳槽中，膠面向陰極。將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉移緩沖液以淹沒膠，低溫電泳(4°C )，100V, I小時30分鐘。
[0075]4)含3%BSA的PBS封閉3小時。
[0076]5)將PVDF膜放入濕盒內，孵一抗，4°C過夜。
[0077]一抗?jié)舛葹?1: 500
[0078]6) 1%TBST 洗膜，5 分鐘，6 次
[0079]7) 二抗?jié)舛染鶠?: 2000，室溫放置I小時
[0080]8) 1%TBST 洗膜，5 分鐘，6 次，
[0081]9)辣根過氧化酶顯色，結果見圖3。
[0082](二)細胞免疫熒光染色法檢測分離培養(yǎng)細胞中表皮干細胞標準物β I整合素和ckl9的表達:
[0083]I)用IV型膠原溶液無菌條件下包被準備好的蓋玻片，方法同前；
[0084]2)0.25%胰蛋白酶消化收集第2代或第8代ESC (人表皮干細胞)，并制成單細胞懸液，濃度調整為約5 X IO5個/mL ；
[0085]3)將蓋玻片置于24孔細胞培養(yǎng)板中，滴加0.5mL的單細胞懸液；
[0086]4)待細胞貼壁后，加入適量K-SFM，于37°C 5% CO2培養(yǎng)；
[0087]5)取密度及狀態(tài)均較良好的細胞爬片，0.01MPBS漂洗三次；
[0088]6) 1%BSA(去離子水配)封閉 30minRT ；
[0089]7)1%BSA稀釋的鼠抗人整合素β I單克隆抗體，1:100，4°C過夜；
[0090]8)復溫 30minRT ；
[0091]9)PBS 洗 5minX3 次；
[0092]10) 1%稀釋的TRITC標記的驢抗鼠IgG, I: 500, 37°C I小時閉光；
[0093]11)PBS 洗 5minX3 次；
[0094]12)加兔抗人角蛋白(0()19多克隆抗體，1:10041:過夜；
[0095]13)復溫 30minRT ；
[0096]14)PBS 洗 5minX3 次；
[0097]15)加相應FITC標記的山羊抗兔IgG，37°C I小時閉光；
[0098]16) 0.01MPBS 洗滌三次，3min/ 次；
[0099]17) 75% 甘油封片；
[0100]18)熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察染色情況并拍照，結果見圖4。
[0101](三)流式細胞儀檢測分離培養(yǎng)細胞表皮干細胞標準物a6-1ntegrin及⑶71的表達
[0102]I)取細胞培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次；
[0103]2) 0.25% 胰酶 3mL，37°C，消化細胞 2min;
[0104]3)倒置顯微鏡下觀察細胞回縮，形態(tài)變圓，個別細胞脫壁漂浮即用10%FBS+RPMI1640 終止消化；
[0105]4)輕柔吹打細胞使大部分細胞脫壁，收集細胞懸液離心；1000rpm，5min;[0106]5) PBS 重懸，EP 管收集離心 lOOOrpm，5min
[0107]6)細胞計數(shù)，調整細胞密度:106個細胞/300 μ LEP管
[0108]7)ΡΕ標記的鼠抗人a 6-1ntegrin單抗和(或)FITC標記的鼠抗人CD71單抗，對照管加入對應于一抗的正常實驗動物IgG，4°C 60min ；
[0109]8)流式細胞儀檢測，結果見圖5。
[0110](四)克隆形成實驗檢測表皮干細胞克隆形成能力
[0111]I)將培養(yǎng)細胞接種于預先用IV型膠原包被的六孔板中(1000個/六孔板每孔)；
[0112]2)加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基，置于37°C、5%C02孵箱內培養(yǎng)，每2天換液I次，培養(yǎng)兩周(10-14天)；
[0113]3) PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗2遍；[0114]4) 0.1%結晶紫溶液室溫染色15min，PBS洗5遍；
[0115]5)分別使用數(shù)碼照相機和倒置顯微鏡觀察拍照；
[0116]6)計數(shù)克隆數(shù)及克隆形成率，每個克隆應至少包括32個細胞?？寺⌒纬陕?％) =克隆數(shù)/接種細胞數(shù)X 100。實驗結果見圖6。
[0117](五)實驗結果
[0118]如圖1所示，采取IV型膠原快速黏附法對ESC進行分離培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)細胞形態(tài):快速黏附細胞(貼壁lOmin,RapidAdherentCells, RAC)均勻分布、牢固貼附于培養(yǎng)瓶底部，細胞呈圓形，體積較??；如圖1a所示培養(yǎng)24h后細胞明顯伸展為扁平或多角形，核漿比例大；如圖b所示培養(yǎng)第7天，細胞形成小克隆，胞體緊密相靠，胞膜相互銜接，呈典型“鋪路石”樣生長；培養(yǎng)第10天，細胞增殖明顯加快，部分小克隆相互連接，克隆變大，第12-14天，可見圓形、橢圓形或不規(guī)則形狀的大克隆形成，細胞連接成片，如圖c所示；如圖d所示，高倍鏡下示細胞形態(tài)較一致，體積較小，胞核大，核質比高，細胞間連接緊密。這些現(xiàn)象均符合ESC的形態(tài)生長特點。
[0119]如圖2所示，細胞培養(yǎng)至第8代時仍能成典型“鋪路石”克隆樣生長，細胞狀態(tài)良好。
[0120]如圖3所示，第2代及第8代表皮干細胞中CK19、β I整合素均有清晰蛋白條帶。
[0121]如圖4所示，免疫熒光染色并利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察CK19和整合素β I的表達，F(xiàn)ITC綠色熒光標記的CK19胞漿均呈強陽性表達(200倍)；TRITC紅色熒光標記的β I整合素多數(shù)細胞呈強陽性表達，少數(shù)細胞表達較弱，主要表達于細胞膜(200倍)；FITC綠色熒光標記的K19與TRITC紅色熒光標記的整合素β I雙標合并成像中CK19和整合素β I在絕大多數(shù)細胞均表達，表達強弱有所差別，CK19熒光強度明顯高于整合素β I (200倍)。結果表明，本實驗分離培養(yǎng)的第2代和第8代表皮干細胞均同時表達CK19及β I整合素。
[0122]如圖5所示，體外培養(yǎng)人表皮干細胞流式細胞術測定結果:第2代a 6-1ntegrinbri CD71dim 率為 85.6%,第 8 代 a 6-1ntegrin briCD71dim 率(bri 意思是強陽性，dim 意思是陰性；也可以說a 6-1ntegrin強陽性⑶71陰性)為50.4%。
[0123]如圖6所示，克隆形成能力檢測第2代及第8代體外培養(yǎng)人表皮干細胞均有較強的克隆形成能力，克隆形成率分別為33.1 ±4.8%, 28.6 ±2.9%。
[0124]經多種人表皮干細胞標志物多種實驗方法相關鑒定實驗表明，所培養(yǎng)細胞為表皮干細胞；細胞傳至第8代后表皮干細胞特性仍良好。結果表明，使用本發(fā)明一種人表皮干細胞改良的快速分離、培養(yǎng)方法解決了體外培養(yǎng)人表皮干細胞分化的問題。另外，細胞擴增數(shù)量計算，每瓶25mm2培養(yǎng)瓶細胞生長密度70~80%時細胞數(shù)約為8 X IO5個，按1: 5傳代至第8代時細胞數(shù)約為8 X IO5X 58=3.125 X IO11個細胞；細胞擴增面積保守計算如下，一個成人包皮可獲得表皮細胞約IO7個細胞，約有10%為表皮干細胞。按本實驗使用每25mm2培養(yǎng)瓶接種IO6個表皮細胞計算，可接種面積為250mm2，按1: 5傳代，傳至第8代時細胞生長面積為250mm2X58=97656250mm2=97.656250m2 ^ IOOm2 ;擴增時間計算，原代需兩周，以后每周傳一次代，共需10周，及約為70天。按成人體表面積計算m2=(身高-0.6) X1.5，身高為1.7m成人體表面積約為1.65m2，取該成人包皮按本發(fā)明計算，250mm2 X 54=156250培養(yǎng)細胞約需傳代數(shù)為第4代至第5代，培養(yǎng)時間約為6-7周。因此本發(fā)明在臨床應用中具有廣泛的前 景。
【權利要求】
1.人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:包括如下步驟: a、消毒:將包皮環(huán)切術取下的人包皮組織用0.5%碘伏浸泡I~2min，PBS漂洗至肉眼觀察不再有碘伏著色； b、分離表皮與真皮:修剪掉皮下脂肪組織，組織修剪為約為0.5cmXlcm大小的皮片；加入0.25%的中性蛋白酶II溶液充分覆蓋組織塊，4°C消化12~16h ;棄中性蛋白酶II溶液，PBS清洗后用眼科鑷子分離表皮與真皮，得到表皮組織； C、收集:剪碎表皮組織，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化5~lOmin，終止消化，過濾，離心，PBS洗滌，收集細胞； d、培養(yǎng):用K-SFM培養(yǎng)液將收集的細胞制成2.5 X IO5個/mL的單細胞懸液，接種單細胞懸液于包被了 IV型膠原的培養(yǎng)器皿中，37°C靜置IOmin ;棄未貼壁細胞，用PBS漂洗，加入K-SFM培養(yǎng)液；37°C、5%C02培養(yǎng)；次日更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每2天換液I次； e、傳代:待細胞生長密度為70~80%時，用0.25%胰蛋白酶消化，終止消化，離心，收集細胞，按細胞接種面積擴大4~6倍傳代； 上述所有操作均在無菌條件下進行。
2.如權利要求1所述的人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟b中所述的0.25%的中性蛋白酶II的配置方法為，0.5g中性蛋白酶II溶入IOOmL0.1MPBS中，攪拌溶解，過濾，_20°C保存。
3.如權利要求1或2所述的人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟c中所述的消化是指:步驟d中所述的K-SFM培養(yǎng)液包含下述成分:重組人表皮生長因子rEGF0.1~0.2ng/mL,牛垂體提取物BPE20~30 μ g/mL ；CaCl20.05mM ;青霉素、鏈酶素均為100U/mL。`
4.如權利要求1~3任一項所述的人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟d中所述的包被了 IV型膠原的培養(yǎng)器皿采用如下方法制備:按照10μ g/cm2計算，將適量0.lmg/mL的IV型膠原溶液加入細胞培養(yǎng)器皿中，是液體充分覆蓋培養(yǎng)器皿的培養(yǎng)面，4°C放置約12~24小時，使用前采用PBS清洗。
5.如權利要求1~4任一項所述的人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟e中進行消化前去掉原培養(yǎng)液，并用PBS清洗細胞。
6.如權利要求1~5任一項所述的人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法,其特征在于:步驟e中消化是指在37°C、5%C02下培養(yǎng)6~10分鐘。
7.如權利要求1~6任一項所述的人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法,其特征在于:所述的終止消化采用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。
8.如權利要求1所述的人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的離心為1000rpm/min 條件下離心 5min。
【文檔編號】C12N5/074GK103865872SQ201410112277
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權日:2013年12月10日
【發(fā)明者】詹日興, 羅高興, 吳軍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院