專利名稱：水母雪蓮毛狀根細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種水母雪蓮毛狀根細(xì)胞系。
背景技術(shù)：
水母雪蓮是藏藥“恰羔素巴”之正品。主要分布于海拔3900-5600米的高寒冰緣地帶，為青藏高原特有植物品種，是名貴藥用植物，藏醫(yī)中用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦科病及高山反應(yīng)等癥。雪蓮由于其分布區(qū)自然條件極為惡劣氣溫低，冷季干旱而漫長，暖季短暫，植物生長季僅90-150天。水母雪蓮一般3-5年才能夠成熟開花，一般高度在30厘米左右，甚至更低。使得水母雪蓮的自然資源極其有限。雪蓮分布的地區(qū)植物群落結(jié)構(gòu)簡單，植物的多樣性指數(shù)很低，同時(shí)由于植物的生物量較低，生態(tài)系統(tǒng)一旦破壞將難以恢復(fù)。
故為人工栽培水母雪蓮，中國科學(xué)院植物研究所的200310121348.8的專利申請中公開了一種水母雪蓮毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)雪蓮多糖類有效成份的方法，該方法是利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導(dǎo)水母雪蓮得到毛狀根，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根中的多糖含量最高可達(dá)毛狀根干重的5-10％，比野生生藥中的0.5％多糖含量高許多。但該方法的培養(yǎng)目的是為了提高水母雪蓮的毛狀根中的多糖含量，而對其中具有藥用的價(jià)值的生物堿的含量提高無顯著影響。
農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，1907年人們發(fā)現(xiàn)它是植物致瘤的起因，植物細(xì)胞被其侵染后，形成腫瘤。能夠誘發(fā)冠癭瘤的稱為根癌農(nóng)桿菌，誘導(dǎo)毛發(fā)狀根的稱為發(fā)根農(nóng)桿菌。受感染的細(xì)胞可產(chǎn)生正常細(xì)胞所不能產(chǎn)生的生物堿-冠癭堿，被農(nóng)桿菌利用作為碳源和氮源。
經(jīng)過持續(xù)不斷的基礎(chǔ)研究，直到1974年，發(fā)現(xiàn)在根癌和發(fā)根農(nóng)桿菌中分別有一種環(huán)型的Ti或Ri質(zhì)粒，質(zhì)粒上的一段T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)包含有生長素基因和細(xì)胞分裂素基因，它可以插入植物基因組從而引起細(xì)胞特性的變化。由于T-DNA能夠進(jìn)行高頻率轉(zhuǎn)移，而且Ti質(zhì)粒上可插入大到50kb的外源DNA，因此可以利用這種天然的遺傳轉(zhuǎn)化體系，將外源DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，并利用植物細(xì)胞的全能性，經(jīng)過細(xì)胞或組織培養(yǎng)，由一個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成完整的轉(zhuǎn)基因植物。
在迄今發(fā)展起來的轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化占據(jù)主導(dǎo)地位，應(yīng)用最為廣泛，特別是在雙子葉植物上尤其普遍。近幾年來農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化在水稻等谷類作物上取得成功，其應(yīng)用范圍將進(jìn)一步擴(kuò)大。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化頻率高，可轉(zhuǎn)移較大的DNA片段，所轉(zhuǎn)移DNA很明確地為T-DNA左右邊界之間的序列，并可直接用不同的植物組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，不需要原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株的技術(shù)，從而提高轉(zhuǎn)育周期。
發(fā)根農(nóng)桿菌是一種寄主非常廣泛的土壤細(xì)菌，能夠侵染幾乎所有的雙子葉植物和少數(shù)的單子葉植物。發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒被廣泛的應(yīng)用于植物基因工程、植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)、植物品種改良和植物的栽培中。其轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的毛狀根有如下優(yōu)點(diǎn)1)毛狀根具有生長迅速，激素自主性，2)可以方便的轉(zhuǎn)入外源基因，3)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物的毛狀根分化正常植株的頻率高，倍性穩(wěn)定，容易建成系列，4)無性系擁有親本特征次級代謝途徑，且次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力高、含量穩(wěn)定，5)毛狀根來源于一個(gè)單細(xì)胞，為優(yōu)良系的篩選提供了極大的方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種水母雪蓮毛狀根細(xì)胞系，該細(xì)胞系是利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染水母雪蓮并由水母雪蓮?fù)庵搀w上誘導(dǎo)形成毛狀根，從而提高了水母雪蓮毛狀根中的生物堿含量，其含量最高可達(dá)毛狀根干重2.1％。
本發(fā)明的目的可通過如下措施來實(shí)現(xiàn)一種水母雪蓮毛狀根系高原R0405，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，10080，電話010-62542758)，保藏日期2005年12月05日，保藏號CGMCC No.1557，建議分類命名為Saussurea medusa；該水母雪蓮細(xì)胞系具有以下特征此系具有毛狀根的形態(tài)，根生長迅速具有多層分枝，能夠在無激素MS培養(yǎng)基上自主生長。生物堿含量高。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果由發(fā)根農(nóng)桿菌A4侵染水母雪蓮子葉獲得的發(fā)根系能夠在無激素的培養(yǎng)基上自主生長，而且生長速度快，分枝頻率高。使離體培養(yǎng)條件下生物量在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)的積累的達(dá)到接種量的5-15倍。毛狀根中的生物堿含量，其含量最高可達(dá)毛狀根干重的2.1％。這些優(yōu)點(diǎn)有利于以后的生物反應(yīng)器培養(yǎng)。有助于水母雪蓮離體條件下的大規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)有效次生代謝物具體實(shí)施方式
以下將參照具體實(shí)施例以詳述本發(fā)明。
實(shí)施例一一種水母雪蓮毛狀根系的誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法，其包括如下步驟(1)取無菌水母雪蓮種子，接種至幼苗培養(yǎng)基進(jìn)行幼苗培養(yǎng)，獲得無菌幼苗；(2)以所述步驟(1)獲得的無菌幼苗的子葉作為外植體放入預(yù)培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)；(3)將所述步驟(2)中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的子葉外植體經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌A4的介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)化；(4)將所述步驟(3)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的子葉外植體再放回所述步驟(2)的預(yù)培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)；(5)將所述步驟(4)進(jìn)行暗培養(yǎng)的子葉外植體放入抑菌培養(yǎng)基中進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)，直至在外植體上形成毛狀根；(6)將所述(5)抑菌培養(yǎng)的具有毛狀根的外植體放入毛狀根擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)。
所述步驟(1)的幼苗培養(yǎng)是將無菌水母雪蓮種子置于無激素的MS培養(yǎng)基中、20-25℃下培養(yǎng)。。
所述步驟(2)的子葉外植體在預(yù)培養(yǎng)基中進(jìn)行的暗培養(yǎng)是將外植體放入預(yù)培養(yǎng)基在20-25℃下培養(yǎng)24-48h；所述的預(yù)培養(yǎng)基包括下述含量的組份MS基本培養(yǎng)基、2.0-10mg/L生長素、0.2-1mg/L細(xì)胞分裂素。
所述的步驟(3)中的預(yù)培養(yǎng)子葉外植體經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化是將預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸入發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液中，浸泡6-12min，以進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。
所述的發(fā)根農(nóng)桿菌液是將發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株置入YEP液體培養(yǎng)基中，在25-29℃、180r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)過夜；然后將菌液進(jìn)行離心分離棄上清液，用無激素MS培養(yǎng)基重懸浮并稀釋到OD＝0.4-0.8，所述OD值為農(nóng)桿菌菌液在260nm光波下的光吸收值。
所述的步驟(4)中的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的子葉外植體的共培養(yǎng)是將介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的外植體放入預(yù)培養(yǎng)基中在25-29℃下培養(yǎng)24-48h；所述的預(yù)培養(yǎng)基包括下述含量的組份MS基本培養(yǎng)基、2.0-10mg/L生長素、0.2-1mg/L細(xì)胞分裂素。
所述的生長素選自2，4-D、NAA、IAA中的一種。
所述的細(xì)胞分裂素選自6-BA、KT、ZT中的一種。
所述的步驟(5)將介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的子葉外植體進(jìn)行暗培養(yǎng)后的外植體再進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)是將介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的子葉外植體進(jìn)行暗培養(yǎng)后的外植體放入抑菌培養(yǎng)基中于20℃±5℃、24-48h黑暗中進(jìn)行至少五次的繼代抑菌培養(yǎng)，直至將菌除凈。
所述的抑菌培養(yǎng)基包括下述含量的組份無任何激素的MS基本培養(yǎng)基、第一抗菌素400-600mg/L。
所述的第一抗菌素選自頭孢唑啉鈉、頭孢拉啶中的一種。
所述的步驟(6)中將具有毛狀根的外植體放入毛狀根擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)是指將抑菌培養(yǎng)的具有毛狀根的外植體放入毛狀根擴(kuò)增培養(yǎng)基中，20℃±5℃、24-48h黑暗中進(jìn)行毛狀根擴(kuò)大培養(yǎng)。
所述的毛狀根擴(kuò)增培養(yǎng)基包括下述含量的組份MS基本培養(yǎng)基、第二抗菌素400-600mg/L。
所述的第二抗菌素選自羧芐青霉素、羧茚青霉素中的一種。
所述的抑菌培養(yǎng)基和毛狀根擴(kuò)增培養(yǎng)基中還包括下述含量的組份水解酪蛋白250-350mg/L、肌醇100-300mg/L、Vc 1-3mg/L、檸檬酸2-6mg/L、蔗糖濃度3-8％、瓊酯粉0.2-0.8％。
其更具體的實(shí)施方式如下水母雪蓮毛狀根細(xì)胞系的制備方法，包括如下步驟(1)將水母雪蓮的種子滅菌，于超凈工作臺上接種到無激素MS培養(yǎng)基中，20℃培養(yǎng)獲得無菌幼苗；(2)取水母雪蓮的無菌幼苗，將無菌幼苗、子葉、葉柄和胚軸剪成1cm左右的小段，轉(zhuǎn)入預(yù)培養(yǎng)基中20℃暗培養(yǎng)2天；所述預(yù)培養(yǎng)基包括下述含量的組份MS培養(yǎng)基、2.0mg/L 2，4-D生長素、0.2mg/L細(xì)胞分裂素，(3)將預(yù)培養(yǎng)2D的水母雪蓮的各種外植體浸入發(fā)根農(nóng)桿菌液中，浸泡8min，將預(yù)培養(yǎng)的外植體經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株的介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后在無菌濾紙上吸去多余的菌液；(4)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的外植體再放回原來的預(yù)培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)2天；(5)將暗培養(yǎng)2D后的外植體轉(zhuǎn)接到附加了500mg/L頭孢唑啉鈉(cef)的MS無激素培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌抑菌繼代培養(yǎng)；隔2天轉(zhuǎn)接一次，5次后，將轉(zhuǎn)接周期適當(dāng)延長，直至將菌除凈；(6)將所述(5)抑菌培養(yǎng)的具有毛狀根的外植體放入附加了500mg/L羧芐青霉素(car)的MS無激素培養(yǎng)基上進(jìn)行毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)。
其中，所述的發(fā)根農(nóng)桿菌液的制取如下挑取發(fā)根農(nóng)桿菌的單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min培養(yǎng)過夜。將菌液于離心管中4000r/min離心10min。棄上清，用無激素MS液體培養(yǎng)基重懸浮并稀釋到OD＝0.6。
其中MS培養(yǎng)基中的各元素的含量如下(mg/L)MgSO4·7H2O 370 CaCl2·2H2O 440KNO31900 NH4NO31650 KH2PO4170FeSO4·7H2O 27.8 Na2EDTA 37.3 MnSO4.4H2O 11.2ZnSO4·7H2O 4.3 CuSO4.5H2O 0.0125KI 0.42H3BO33.1 Na2MoO4.2H2O 0.125CoCl2.6H2O 0.0125Glycine1 VB6-0.25VB10.05 Nicotinicacid 0.25在外植體預(yù)培養(yǎng)、抑菌培養(yǎng)及擴(kuò)增培養(yǎng)過程中所用培養(yǎng)基中蔗糖濃度為3％-8％范圍內(nèi)，水解酪蛋白300mg/L，肌醇200mg/L，Vc 2mg/L，檸檬酸4mg/L，PH5.8，瓊脂粉約0.5％。20℃±1℃黑暗中培養(yǎng)。
所述的YEB培養(yǎng)基作為發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)基，其中的各元素的含量如下(mg/L)蛋白胨(peptone) 5000酵母提取物(yeast extract powder) 1000牛肉浸膏(Beef Extract) 5000MgSO4·7H2O 495PH 7.0經(jīng)過上述的誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟后，水母雪蓮的各種外植體在附加抗生素cef的無激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，子葉外植體上愈傷組織然后再在愈傷組織上形成毛狀根，而葉柄和胚軸外植體多直接形成毛狀根。毛狀根生長至1-2cm時(shí)，將其切下繼續(xù)接在無激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，毛狀根能夠在無激素培養(yǎng)基上自主生長。在培養(yǎng)過程中抗生素cef有利于外植體先形成愈傷組織和毛狀根的分化，但不利于毛狀根的生長和分枝。而在附加了car的MS無激素培養(yǎng)基上毛狀根能夠迅速生長和分枝。
對篩選出的根系進(jìn)行PCR檢測和農(nóng)桿堿電泳檢測，以確定T-DNA的插入。
經(jīng)上述方法誘導(dǎo)培養(yǎng)10-14天后，各外植體均在切口處產(chǎn)生愈傷組織。約3周后開始一些外植體上出現(xiàn)根。之后形成根的外植體和根的數(shù)量不斷增多。每塊外植體上根的數(shù)量從1到30條不等。以毛狀根的誘導(dǎo)率為標(biāo)準(zhǔn)，選擇出水母雪蓮毛狀根誘導(dǎo)的最適條件以水母雪蓮子葉為外植體，發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的濃度為OD＝0.6，毛狀根的誘導(dǎo)率是78.7％。得到的毛狀根具有不同的分枝和生長狀況。在進(jìn)行毛狀根培養(yǎng)研究的過程中發(fā)現(xiàn)在附加了cef的培養(yǎng)基上毛狀根只伸長極少分枝，而且毛狀根隨著生長只有剛伸長的部分保持良好的生長狀態(tài)，其余的逐漸褐化。當(dāng)毛狀根轉(zhuǎn)接到附加了car的無激素培養(yǎng)基則生長迅速且分枝多。
對毛狀根系進(jìn)行PCR檢測。根據(jù)T-DNA區(qū)的ROL基因序列分別設(shè)計(jì)RolA、RolB、RolC基因的引物，通過擴(kuò)增得到相應(yīng)分子量的特異條帶。證明了T-DNA插入水母雪蓮基因組誘導(dǎo)形成毛狀根的可能性。
對毛狀根提取物進(jìn)行農(nóng)桿堿電泳檢測，毛狀根樣品中出現(xiàn)水母雪蓮原植物中沒有的斑點(diǎn)。說明農(nóng)桿菌基因已經(jīng)整合到植物基因組中并表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種水母雪蓮毛狀根細(xì)胞系R0405，其保藏號為CGMCC No.1557。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水母雪蓮毛狀根細(xì)胞系R0405，其保藏號CGMCCNo.1557；本發(fā)明的水母雪蓮毛狀根細(xì)胞系能夠在無激素培養(yǎng)中自主生長，而且毛狀根中的生物堿含量得到提高，可達(dá)到干重的2.1％。將有利于離體培養(yǎng)條件下生產(chǎn)目的產(chǎn)物研究，并有助于下一步解決天然雪蓮資源匱乏的問題的研究。
文檔編號C12N5/04GK1966673SQ20051002279
公開日2007年5月23日 申請日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者王莉, 李毅 申請人:中國科學(xué)院西北高原生物研究所